丁酸梭菌对犊牛肠道致病菌的抑菌作用和抗氧化性能研究

 

摘要：试验旨在研究丁酸梭菌对犊牛肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)的抑制作用和抗氧化性能。采用牛津杯法进行抑菌试验，以抑菌圈直径值判定丁酸梭菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制效果。抗氧化试验以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟基自由基、超氧阴离子清除能力及还原力为依据。结果显示：上清液对3种指示菌的抑制作用最显著，均显著高于菌悬液、无细胞提取物和无菌蒸馏水(P<0.05)；菌悬液和无细胞提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用次于上清液，显著高于无菌蒸馏水(P<0.05)，且二者之间差异不显著(P>0.05)。丁酸梭菌上清液对DPPH自由基清除率显著高于菌悬液和无细胞提取物(P<0.05)；上清液和菌悬液对羟基自由基清除率显著高于无细胞提取物(P<0.05)；上清液对超氧阴离子自由基清除率显著高于菌悬液和无细胞提取物(P<0.05)；还原力排序为上清液>菌悬液>无细胞提取物(P<0.05)。研究表明，丁酸梭菌对犊牛肠道致病菌具有一定的抑制作用，且具备抗氧化能力。

关键词：丁酸梭菌；抑菌作用；抗氧化能力

肠道是动物体重要的消化和免疫器官，不仅能够消化吸收饲粮中的营养物质，还可监视和清除其中的条件性致病菌和外源菌。肠道功能受损则可能导致动物营养吸收受阻、生长性能降低、免疫力低下，严重时甚至死亡。因此，维持肠道健康对提高动物生产性能具有重要意义。在犊牛养殖中，肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌等会引起犊牛发生腹泻等多种肠道问题，影响肠道健康，降低养殖经济效益。丁酸梭菌作为益生菌添加剂，是一类潜在的抗生素替代品，在畜禽腹泻和肠道健康方面发挥着积极的作用。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)广泛分布于人和动物的肠道中，是一种能产生短链脂肪酸，如丁酸和乙酸的革兰氏阳性厌氧菌。丁酸梭菌能调节动物肠道微生态平衡，提高畜禽机体免疫力和抗氧化能力，促进动物生长发育。丁酸梭菌作为微生态制剂，是一类潜在的抗生素替代品，在预防幼龄动物腹泻、改善肠道健康和免疫力方面发挥着积极的作用。丁酸梭菌体代谢产生短链脂肪酸，可降低肠道pH值，从而抑制有害菌生长，减少有害菌在肠道内定植，还可通过营养竞争，抑制有害菌生长，其代谢物质中含有的蛋白类或多肽类物质也对有害菌具有抑制作用。

因此，本试验通过体外试验研究丁酸梭菌对引起犊牛腹泻主要致病菌的抑制作用及抗氧化作用，进而进一步揭示丁酸梭菌的益生作用及机理，为益生菌的推广使用及犊牛健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

丁酸梭菌(活菌数为1×1010CFU/g)购自某生物科技有限公司，大肠杆菌(K99)本实验室自主分离，沙门氏菌及金黄色葡萄球菌购自某科技有限公司。所使用的培养基为LB和RCM培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 生长曲线

在RCM液体培养基中接种2%的丁酸梭菌，置于37 ℃厌氧条件下培养24h，每2h取一次样，测定吸光度(OD600nm)，并用酸度计测定pH值。根据相应结果分别制作生长曲线和pH值曲线。

1.2.2 产丁酸能力测定

按上述方法培养丁酸梭菌，取30mL培养24h的菌液，超声振荡0.5h后，12000r/min离心20min，获得的上清液过0.22μm滤膜，最终获得提取液。使用高效气相色谱(GC)法检测24h发酵液中丁酸含量。

1.2.3 产酶特性

将丁酸梭菌按照2%的比例接种于RCM液体培养基，37 ℃厌氧培养箱中培养12h，活化2代后，5000r/min离心15min(4℃)，得到的上清为粗酶液。按照文献方法根据绘制的酪氨酸标准曲线和葡萄糖标准曲线分别计算蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性。

1.2.4 牛津杯抑菌试验

为评估丁酸梭菌对犊牛肠道致病菌的抑菌性能，选择大肠杆菌K99、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为指示菌。

(1)发酵上清液、菌悬液和无细胞提取物的制备。

将丁酸梭菌菌液6000r/min离心10min(4℃)，获得上层的上清液和下层的菌泥，随后用于制备发酵上清液、菌悬液和无细胞提取物。制备方法为：

发酵上清液：将上述获得的上清液在8000r/min离心15min(4℃)，进行无菌过滤。

菌悬液：上述初步获得的菌泥，用无菌PBS洗涤3次，重悬于无菌PBS溶液中，调整丁酸梭菌的活菌数(1.0× 108 CFU/mL)。

无细胞提取物：将上述获得的菌悬液超声破碎后在显微镜下镜检，确保完全破碎。破碎后的菌悬液，12 000 r/min离心30min(4℃)，获得的上清是无细胞提取物，-20℃保存备用。

(2)制备指示菌涂布平板。

以致病菌大肠杆菌K99、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，分别置于37℃摇床培养24h，按20倍进行稀释，取200μL指示菌稀释液涂布在准备好的LB培养基上，静置30min后，采用牛津杯法测定抑菌圈。在已涂布致病菌的平板上分别放置3个已灭菌的牛津杯，在牛津杯中加入丁酸梭菌的200μL无菌体发酵液(对照组加等量无菌LB液体培养基为对照)，37℃培养24h，用游标卡尺测定抑菌圈的直径(DIZ)。

1.2.5 体外抗氧化试验

(1)DPPH自由基清除能力。

分别取2mL上述丁酸梭菌发酵上清液、菌悬液和无细胞提取物，分别加入DPPH自由基溶液(2×104mol/L)2mL，充分混匀后，37℃避光反应30min，测定吸光度(A517am)。按照公式计算清除率：

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A₂)/A0]×100%

(1)式中：A0为对照组吸光度的测定值；A1为样品待测液吸光度测定值；A₂为空白组吸光度的测定值。

(2)羟基自由基清除能力。

依据徐雅芫方法测定羟基自由基的清除率，计算公式如下：

羟基自由基清除率=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

(2)式中：A0为蒸馏水代替过氧化氢溶液的吸光度测定值；A1为生理盐水代替样液吸光的测定值；A2为样液反应体系吸光度的测定值。

(3)超氧阴离子自由基清除能力。

将0.1mL待测液加入4.5mL的Tris-HCI缓冲液(pH值8.0)中，25℃静置20min，加入邻苯三酚(25mmol/L)0.4 mL，在25℃条件下反应5min，加入2滴8 mol/L的HCl以终止反应，测定325nm吸光度(A1)。无菌水替代待测液作为空白组，测定的吸光度(A0)，计算超氧阴离子清除率：

超氧阴离子自由基清除率=( A0- A1)/ A0×100%

(3)式中：A0为空白组的吸光度；A1为样液反应体系的吸光度。

(4)还原力测定。

取0.5mL磷酸缓冲溶液(0.2mol/L、pH值6.6)、0.5mL铁氰化钾(1%)及0.5mL待测样品，于50℃水浴锅中反应20min，取出迅速进行冰浴冷却，加入10%三氯乙酸0.5 mL，4000r/min离心5min，收集1mL上清液，将取无菌水1mL和0.1%三氯化铁1mL加入上清液，充分混合均匀，在37℃恒温箱中放置10min后取出，测定710 nm吸光度，计算还原力。

还原力=( A1- A0) A1×100%

(4)式中：A1为样液反应体系测定的吸光度；A0为生理盐水代替样液的反应体系测定的吸光度。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用SPSS21进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 丁酸梭菌的生长曲线(见图1)

由图1可知，在培养的0～4h之间，丁酸梭菌菌体浓度相对较低，表示其生长缓慢；4h以后丁酸梭菌生长速度明显加快，其进入了生长对数期，此时菌体量迅速上升，说明其适应环境能力较强；而在12h之后生长曲线几乎趋于稳定，此时丁酸梭菌进入了生长稳定期，其菌体量虽然有所增加，但速度非常缓慢，在此时其生长速率、生理活性均有所下降，代谢产物仍持续积累。

2.2 丁酸梭菌的pH值和产丁酸曲线(见图2)

由图2(a)可知，丁酸梭菌培养液的pH值经历了3个时期，即滞留期、生长对数期和稳定期。在前期0～4h，培养液的pH值变动幅度不大；在4～10h，pH值快速下降；12h后逐渐趋于稳定，最终稳定在4.4左右。由图2(b)可知，丁酸梭菌的丁酸产量变化趋势经历了3个时期，与pH值变化趋势相近。0～4h为培养的初期，此时丁酸梭菌的菌体浓度较低，生长缓慢，因而其丁酸产量较少；随后进入4～12h对数增长期，在这阶段菌体量上升速度快，菌体代谢速度也加快，在12h丁酸产量达到最大；而在12h后，伴随着培养基中营养物质的不断消耗和代谢产物的积累，丁酸梭菌的生长受到抑制，致使丁酸梭菌生长缓慢，丁酸产量趋于稳定。

 2.3 丁酸梭菌的产酶特性(见图3)

由图3可知，丁酸梭菌产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性有所差异。丁酸梭菌产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性分别为65.0、56.0和4.1U/mL。

2.4 丁酸梭菌对肠道有害菌的抑制作用(见表1、图4)

由表1和图4可知，上清液对3种指示菌，即黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均具有显著的抑制作用，且均显著高于菌悬液、无细胞提取物和无菌蒸馏水(P<0.05)；菌悬液和无细胞提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用次于上清液，显著高于无菌蒸馏水(P<0.05)。

表1丁酸梭菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

2.5 丁酸梭菌抗氧化能力测定结果(见图5)

由图5可知，丁酸梭菌上清液对DPPH自由基清除率显著高于菌悬液和无细胞提取物(P<0.05)；上清液和菌悬液对羟基自由基清除率显著高于无细胞提取物(P<0.05)；上清液对超氧阴离子自由基清除率显著高于菌悬液和无细胞提取物(P<0.05)；还原力排序为上清液>菌悬液>无细胞提取物(P<0.05)。

图5丁酸梭菌的抗氧化能力测定结果

3 讨论

3.1 丁酸梭菌生长曲线、pH值和产丁酸量分析

益生菌的生长和产酸能力是衡量其益生作用的重要指标，往往通过测定光密度衡量菌株的生长情况，培养基pH值变化可以反映益生菌的产酸能力。本试验发现，丁酸梭菌在培养4h前生长缓慢，此时pH值变化较小,丁酸产量较少；4h后开始呈现对数生长，pH值急速下降，同时由于菌体内代谢活跃，丁酸产量达到最大；12h后进入稳定期，pH值和丁酸产量趋于稳定。生长曲线可直接反映菌的生长规律，是菌株的一个重要的生物学特性，其可确定菌株发酵的最佳接种时间，并对生理代谢的最佳稳定时期等具有一定指示作用。本试验中丁酸梭菌生长曲线与陈俊超等和阳田恬等研究结果相似。随着丁酸梭菌培养时间的延长，菌体在不断增长，在丁酸梭菌生长过程会产生大量代谢产物，如有机酸等，这些代谢产物不断进行积累，而培养液中营养物质被持续消耗，最终导致不能满足丁酸梭菌的生长需要，菌体之间发生激烈竞争，造成pH值降低。本试验中，随着培养时间延长，pH值逐渐降低，最后稳定在4.4左右。这与白璐佳研究结果一致。丁酸是丁酸梭菌在生长过程中产生的非常重要的代谢产物，丁酸可作为能源底物供给畜禽肠道上皮细胞生长和发育，具有调节肠道免疫稳态、增强肠道屏障功能和缓解炎症的作用。本试验中，丁酸梭菌在培养12h产丁酸趋于稳定。这与常世恺等研究结果相似。王腾浩等研究表明，丁酸梭菌24h发酵液中丁酸含量为1.87g/L。廖秀冬研究表明，丁酸梭菌最大丁酸产量是1.58g/L。高文文等研究表明，筛选出的14株人源丁酸梭菌中最大丁酸产量为2.156g/L。而本试验中，丁酸梭菌培养中丁酸最大产量为1.21g/L，丁酸梭菌产丁酸能力可能与其来源及机体代谢有关。

3.2 丁酸梭菌的产酶特性分析

丁酸梭菌作为益生菌，能够产生短链脂肪酸、消化酶、维生素和抗菌肽等有益代谢产物。本试验中，丁酸梭菌能产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶。这些酶能够促进畜禽对饲料中营养物质的消化和利用，尤其是畜禽自身不能合成的纤维素酶。因此，畜禽采食丁酸梭菌后，能在一定程度上改善单胃动物对粗纤维的消化，提高营养成分的利用率，提高畜禽的生产性能。亓秀晔等筛选到的3株鸡源丁酸梭菌，其蛋白酶和脂肪酶活性均高于本试验结果。这可能是由于菌株和酶活检测方法不同造成。

3.3 丁酸梭菌对畜禽肠道有害菌的抑制作用分析

肠道健康与畜禽机体健康和生产性能直接相关。而金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等是在畜牧生产中常见能够引起畜禽发生肠道疾病的几类致病菌，这些致病菌会通过肠道黏膜侵入宿主，并在宿主体内产生有害物质，如毒素等，进而造成畜禽肠道微生物的生态平衡的失调，影响畜禽肠道内稳态和抗病能力，给生产带来经济损失。丁酸梭菌可通过抑制大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等肠道有害菌对畜禽胃肠道的菌群平衡进行的调控。

亓秀晔等筛选出3株鸡源丁酸梭菌，并对丁酸梭菌的抑菌性进行了研究，发现这3株菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均具有明显的抑制作用。阳田恬等从动物粪便、瘤胃液和窖泥中最终筛选出两株丁酸梭菌，菌株培养上清液对多种沙门氏菌和产气荚膜梭菌抑制作用显著。丁酸梭菌的上清液对不同来源的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均有明显的抑制作用，且抑菌作用效果与丁酸梭菌菌株有关。本试验中，丁酸梭菌上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌抑制效果显著高于其菌悬液，与前人研究结果一致。丁酸梭菌主要代谢产物丁酸具有较好的抑菌作用，其对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌均具有抑制作用，并且与常规的抗菌药物有所不同，细菌对丁酸等短链脂肪酸不会产生广泛的耐药性。由丁酸梭菌产生的短链脂肪酸会降低肠道pH值，致使病原菌无法生存，试验证实在体外条件下，丁酸梭菌可通过调节pH值抑制肠炎沙门菌增殖。此外，丁酸梭菌代谢产物中含有抗菌活性的丁酸菌素，丁酸菌素是公认的抗菌肽，能够抑制或杀灭动物肠道大肠杆菌、致病性沙门菌等有害菌。丁酸梭菌在肠道中可与有害菌竞争营养物质黏附位点，进而抑制有害菌的生长繁殖，丁酸梭菌的脂磷壁酸也可抑制有害菌在细胞上的附着。研究发现，丁酸梭菌能够恢复致病菌感染造成的肠道内厌氧细菌减少，保证肠道内的厌氧环境，抑制有害菌在畜禽肠道内的定植。贾丽楠等研究发现，丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌无抑制作用。造成结果存在差异的原因可能是菌株不同，其代谢特性不同，产生的抑菌物质不同，从而导致各自的抑菌能力不尽相同。

3.4 丁酸梭菌的抗氧化能力分析

多种疾病是由自由基产生的组织损伤造成的，动物机体过多的自由基，以及机体抗氧化功能受损往往会导致畜禽发生应激，进而影响畜禽生产性能，造成养殖经济损失。目前认为丁酸梭菌的抗氧化作用较为突出，机理可能是其通过阻止自由基的扩散，增强动物机体免疫力来提高机体细胞对组织受损的保护性反应。本试验中，丁酸梭菌上清液对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到78.83%和64.21%，清除率显著高于菌悬液和无细胞提取物。阳田恬等研究所筛选的2株丁酸梭菌的上清液对DPPH自由基清除的作用较为明显，清除率甚至近乎100%，清除效果可与维生素C相近。这可能是与丁酸梭菌在发酵过程中产生的具有抗氧化作用的丁酸和氢气等代谢产物有关，丁酸梭菌分泌这些代谢产物后主要存在于发酵液上清液中，具有较好的缓解机体氧化应激和清除自由基的作用。此外，益生菌对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除活性可能与菌体分泌的胞外多糖等活性成分，且与胞外多糖的浓度呈正相关。

本试验中，丁酸梭菌发酵上清液和菌悬液对羟基自由基的清除率分别为59.49%和73.29%，丁酸梭菌上清液对羟基自由基清除率与菌悬液效果无显著差异，但作用效果均明显高于无细胞提取物。这说明丁酸梭菌可能通过自身菌体或菌体表层自由基，即通过活菌细胞发挥清除羟自由基的作用，其次是代谢产物。无细胞提取物的抗氧化能力较差，原因可能是菌体细胞中不含或仅有少量的抗氧化活性物质，且在制取无细胞提取物的过程中，导致部分活性成分流失。HAN等发现，丁酸梭菌可以抑制羟基自由基，并具有一定的降低过氧化氢浓度的作用，推测其与丁酸梭菌的代谢产物氢气有关。此外，张俊等研究表明，乳酸菌清除羟基自由基的活性物质并非来自胞内，而主要来自菌体表面及其代谢产物。

4 结论

本试验结果表明，丁酸梭菌对犊牛肠道致病菌中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均具有抑制作用，其中起到抑菌作用的物质主要存在于丁酸梭菌菌液中，且丁酸梭菌培养上清液具备抗氧化能力。因此，丁酸梭菌以培养液形式进行使用效果较好。

参考文献：略。

作者：辛子怡，曹凯铭等2025-02-25网络首发于《饲料研究》