不同种间关系的复配菌组对大鼠生长及脂代谢的影响

 

[摘要]为探讨不同复配关系的菌组对动物生长代谢的影响，本试验选取生长、产酸性能相近的菌株筛选互促菌组(植物乳杆菌J05与酿酒酵母Y21)以及互抑菌组(屎肠球菌B13与酿酒酵母Y21)饲喂SD雄性大鼠。试验共分为7个组：空白对照组(A组)饲喂基础饲粮、抗生素组(B组)饲喂基础饲粮+金霉素(70 mg/kg饲粮)、植物乳杆菌J05单菌组(C组)饲喂基础饲粮+2×1010CFU/kgJ05、屎肠球菌B13单菌组(D组)饲喂基础饲粮+2×1010CFU/kgB13、酿酒酵母Y21单菌组(E组)饲喂基础饲粮+6.6×108CFU/kgY21、互促菌组(F组)饲喂基础饲粮+2×1010CFU/kgJ05+6.6×108CFU/kgY21、互抑菌组(G组)饲喂基础饲粮+2×1010CFU/kg B13+6.6×108 CFU/kg Y21。试验共饲喂28d。结果表明:各组间平均日采食量差异显著(P<0.05)，其中B组采食量最高，G组采食量最低：与B组相比，G组的平均日增重显著下降了22.48%(P<0.05)，与F组无显著差异，但较F组低。G组的粗蛋白质表观消化率较其余各组均显著降低，其中较A组、B组、F组相比显著下降了3.47%、3.85%、3.26%(P<0.05)：G组血清白蛋白含量与A组和D组相比显著降低了43.89%、55.01%(P<0.05)，较F组低，但差异不显著。肝脏脂代谢相关基因表达分析显示，相较于G组，F组的CYP7A1和FAS基因的表达水平显著上调了105.36%、209.31%(P<0.05)，而G组与各个单菌组均无显著差异。G组与F组的HMG-CoA与LCAT基因的表达量无显著差异。综上所述，本试验筛选出的互抑菌组对大鼠的生长性能和消化性能有消极影响，互促菌组可上调CYP7A1和FAS基因的表达，说明本试验中的菌株互作机制对调控大鼠脂代谢有一定的趋势性影响。

[关键词]植物乳杆菌；屎肠球菌；酿酒酵母；大鼠；生长性能；脂代谢

益生菌具有促进有益菌定植和提高动物生长性能等特性，被作为安全、绿色、有效的抗生素替代品，在动物生产中广泛应用(金旭等，2023)。研究证明，复合益生菌通过改善动物肠道微生态环境，可以减少有害菌的增殖、降低腹泻率、增强机体抗氧化以及免疫力等(牛禹鸰等，2023)，从而提高动物的生长性能(王丽娟等，2024；Huang等，2023；Li 等，2014)，但也有研究发现利用相似的菌株复配，饲喂效果不相同(王晓艳等，2024)，具体原因却鲜见深入分析。基于此，本试验旨在筛选不同互作关系的菌组饲喂动物，初步研究菌组关系对动物生长代谢的影响。前期，本实验室已筛选到一对互促关系的菌组(陈偲等，2023)(植物乳杆菌 JO5 和酿酒酵母Y21)，并证明其明显促进泡菜发酵的进程。因此，本试验在该试验基础上，拟筛选一对互抑菌组用于动物试验，比较菌组关系差异对动物生产的影响，为生产实践中菌株复配提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株:分离筛选及鉴定自发酵泡菜及酸乳样品。指示菌:大肠杆菌ATCC8099、金黄色葡萄球菌(本课题组分离鉴定保存)。

培养基:MRS液体培养基，YPD液体培养基(本课题组配制)。主要试剂:胃蛋白酶、胰蛋白酶(由德国Biofroxx公司提供)。

1.2 备选乳酸菌株生长特性与产酸特性的分析

将乳酸菌以1%的接种量分别接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养24h，每2h取样一次，振荡混匀后，使用酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)测定0D600nm值，剩余培养液以12000r/min离心2min，取上清，测定pH。

1.3 互抑菌组的筛选

1.3.1 发酵上清液的制备

将乳酸菌以1%的接种量分别接种于MRS液体培养基中，将酵母菌以1%的接种量接种于YPD液体培养基中，30℃静置培养 24 h。培养液以6000r/min离心15 min，取上清，使用1mol/L NaOH溶液调节pH至6.0，使用0.22μm滤膜过滤除菌，即得到发酵上清液，4℃保存备用。

1.3.2 筛选互抑菌组

将制备好的乳酸菌发酵上清液按体积分数30%加入到YPD液体培养基中，以同样比例在YPD液体培养基中添加pH6.0的MRS液体培养基作为对照组，以1%接种量接种酵母菌，30℃静置培养24h，振荡混匀后，测定OD600nm值。将制备好的酵母菌发酵上清液按体积分数 30%加入到MRS液体培养基中，以同样比例在MRS液体培养基中添加pH6.0的YPD液体培养基作为对照组，以1%接种量接种乳酸菌，30℃静置培养24 h，振荡混匀后，测定OD600nm值。与对照组相比，选取OD600nm显著低于(P<0.05)对照组的菌组作为试验菌组。

1.4 菌组中乳酸菌生长量与抑菌活性的比较

将植物乳杆菌J05和屎肠球菌B13以1%的接种量接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养24h，每4h取样一次，测定OD600nm值，采用96孔板法测定菌株发酵上清液的抑菌活性，绘制菌株生长曲线与抑菌活性曲线。

1.5 菌组中乳酸菌耐酸能力的比较

模拟人工胃肠液参照《中国药典》(国家药典委员会，2010)中的方法进行配制，人工胃液用1mol/L NaOH调节pH至 2.5，人工肠液调节pH至6.8，均过0.22μm滤膜除菌备用。将乳酸菌培养液与人工胃液和人工肠液按 1∶1 比例混合，37℃静置培养，在1、2、3h进行活菌平板计数，菌株存活率计算公式如下:

菌株存活率/%=（lgN1/lgN0）×100；

式中:N1为经过人工胃液/人工肠液处理后乳酸菌活菌数量，CFU/mL；N0为人工胃液/人工肠液处理前的乳酸菌活菌数量，CFU/mL。

1.6 试验设计与饲养试验

选用21日龄生长状况良好的SPF级SD雄性断奶大鼠70只(从成都达硕实验动物公司购买)，按体重将SD雄性大鼠分为7个处理组，每个处理组10只。试验中基础饲粮采购自成都达硕实验动物公司。空白对照组(A组)饲喂基础饲粮、抗生素组(B组)饲喂基础饲粮+金霉素(70mg/kg饲粮)、植物乳杆菌J05单菌组(C组)饲喂基础饲粮+2×1010CFU/kg J05、屎肠球菌B13单菌组(D组)饲喂基础饲粮+2×1010CFU/kg B13、酿酒酵母Y21单菌组(E组)饲喂基础饲粮+6.6×108CFU/kgY21、互促菌组(F组)饲喂基础饲粮+2×1010CFU/kgJ05 +6.6×108 CFU/kgY21、互抑菌组(G组)饲喂基础饲粮+2×1010CFU/kgB13+6.6×108 CFU/kgY21。预饲期3d，饲喂期28 d，饲喂期间大鼠自由采食和饮水。

1.7 样品采集及指标测定

1.7.1 生长性能

饲喂期间每天准确记录各重复的喂料量与余料量：每隔7d对大鼠进行空腹称重。计算每只大鼠的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)，计算公式如下:

ADFI/g=总采食量/试验天数/大鼠只数：

ADG/g=(末重-初重)/试验天数/大鼠只数：

F/G=平均日采食量/平均日增重。

1.7.2 消化代谢指标

试验结束后，以重复为单位，采集各试验组中大鼠的新鲜粪便，同时收集各试验组中的日粮，-20℃保存备用。将粪便样品解冻后置于65℃恒温烘箱中烘干至风干状态，粉碎后过40目筛，测定养分消化率，计算公式如下:

养分表观消化率/%=100-［（饲料中养分含量×饲料AIA 含量)/ (粪便中养分含量×粪便AIA含量)］×100。

1.7.3 免疫器官指数

试验第29天，所有大鼠断食12h，注射巴比妥钠进行股静脉取血，后将大鼠断颈处死后采集其腹腔内肝脏、脾脏，-80℃保存备测。以重复为单位，对每只大鼠的肝脏和脾脏称重，计算免疫器官指数计算公式如下:免疫器官指数=器官重量/宰前活重。

1.7.4 血清生化指标

取血清解冻，按照试剂盒(购自南京建成生物工程研究所有限公司)说明书测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、血糖(GLU)、丙二醛(MDA)。按照试剂盒(购自上海酶联生物科技有限公司)说明书测定总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)。

1.7.5 脂代谢相关基因表达的测定

采用Trizol法对肝组织进行RNA抽提，测定RNA浓度后进行反转录，所得cDNA在-20℃保存备用。使用实时荧光定量PCR仪(湖南湘仪离心仪器有限公司)进行扩增反应，采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。

1.8 数据处理

试验数据使用SPSS23.0统计分析软件进行t检验，GraphPad Prism8.0.2软件进行单因素方差分析，结果以“平均数±标准差(Mean±SD)”表示，P<0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 备选乳酸菌株生长曲线与产酸曲线

备选乳酸菌株生长曲线与产酸曲线如图1和图2所示，通过测定7株乳酸菌的0D600nm值和pH发现，各菌株无明显差异。

2.2  互抑菌组的筛选

由表1可知，与单菌对照相比，只有B13的发酵上清液对Y21有显著抑制作用(P<0.05)。由表2可知，Y21的发酵上清液对11、B13均有显著抑制作用(P<0.05)。因此，选取屎肠球菌B13和酿酒酵母Y21作为互抑菌组，进一步研究其对大鼠生长代谢的影响。

表1 乳酸菌发酵上清液对酵母菌的影响

注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)：下同。

表2 酵母菌发酵上清液对乳酸菌的影响

注:同行数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.3 菌组中乳酸菌生长量与抑菌活性的比较

由图3和图4可知，J05和B13生长量较一致，二者对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果略有差异，B13在8h抑菌活性达到最大值，J05在20h抑菌活性达到最大值。

2.4 菌组中乳酸菌耐酸能力的比较

由表3可知，J05和B13经人工胃肠液处理后，菌株存活率均无显著差异(P>0.05)。

表3 菌株在人工胃肠液的存活率%

2.5 饲喂试验结果        

2.5.1 菌株组间关系对大鼠生长性能的影响

由表4可知，与A组相比，F组和G组的平均日采食量显著下降了10.77%、17.65%(P<0.05)，与F组相比，G组平均日采食量显著下降了7.71%(P<0.05)：与B组相比，G组的平均日增重显著下降了22.48%(P<0.05)。

表4 0～28d断奶SD大鼠的生长性能

2.5.2 菌株组间关系对大鼠消化代谢性能的影响

由表5可知，与A组、B组和F组相比，G组的粗蛋白质表观消化率显著降低了3.47%、3.85%、3.26%(P<0.05)，其他各组之间无显著差异(P>0.05)。

表5 断奶SD大鼠的消化率%

2.5.3 菌株组间关系对大鼠免疫器官指数的影响

由表6可知，与各组相比，F组和G组脾脏指数均无显著差异(P>0.05)。

表6 断奶SD大鼠的器官指数

2.5.4 菌株组间关系对大鼠血清生化指标的影响

由表7可知，与A组和D组相比，G组血清白蛋白含量显著下降了43.89%、55.01%(P<0.05)。

表7 断奶SD大鼠的血清生化指标

2.5.5 菌株组间关系对大鼠脂代谢相关基因表达的影响

由图5可知，与A组和B组相比，F组的CYP7A1基因和G组的FAS基因表达水平均无显著差异(P>0.05)：与G组相比，F组的CYP7A1和FAS基因表达水平显著上调了105.36%、209.31%(P<0.05)，与E组相比，F组的CYP7A1基因表达水平显著上调了174.34% (P<0.05)，与C组相比，F组的CYP7A1基因表达水平上调但差异不显著(P>0.05)，与C组和E组相比，F组的FAS基因表达水平显著上调了494.56%、262.1%(P<0.05)，而G组与各个单菌组均无显著差异(P>0.05)；与其他各组相比，F组和G组的HMG-CoA和LACT基因表达水平无显著差异(P>0.05)。

3 讨论

3.1 乳酸菌株生长量、抑菌活性、产酸和耐酸能力的比较

前期测定7株乳酸菌的OD600nm值和pH的目的在于表明各菌株的生长性能和产酸能力接近，可以在相同水平下进行互抑菌组的筛选。后期进行植物乳杆菌J05和屎肠球菌 B13 的生长量，抑菌活性以及耐酸能力的比较，目的在于保证菌株之间的差异较小，不影响其组间关系，如果单菌本身差异太大，菌株种间关系可能是因为单菌差异太大造成的，而不是菌株相互作用产生的。

3.2 菌株组间关系对大鼠生长和血清生化指标的影响

研究表明，乳酸菌能够在肠道内产酸，抑制病原菌的生长(Wulandari等，2018)；酿酒酵母能满足乳酸菌的营养需求并产生大量促生长因子，从而提高畜禽的生长性能(姚志芳等，2020)。本试验结果显示，与抗生素组相比，饲粮中添加互抑菌组使大鼠平均日增重显著下降(P<0.05)，说明B13和Y21之间可能存在营养竞争机制，使其活菌数量降低，从而抑制大鼠生长。研究表明，乳酸菌可增强肠道内养分消化和吸收(Vigors等，2016)，酵母菌或酵母培养物可以提高动物的粗蛋白质、粗纤维等营养物质的消化吸收(唐海翠等，2006)，提高饲粮适口性(袁园等，2018)。本试验结果显示，与对照组、抗生素组和互促菌组相比，饲粮中添加互抑菌组使大鼠粗蛋白质表观消化率显著降低(P<0.05)，说明B13可能通过产酸抑制Y21的增殖，从而减弱大鼠对饲粮中主要养分的消化和吸收。白蛋白和球蛋白可以反映机体的蛋白代谢水平和机体免疫能力，本试验结果显示，饲粮中添加互抑菌组使大鼠血清白蛋白含量显著降低(P<0.05)，说明互抑菌组的大鼠蛋白代谢较差，降低了大鼠机体免疫力，陈鑫珠(2017)发现，饲喂酵母菌和乳酸菌提取混合物降低了闽东山羊血清中的白蛋白含量，本试验结果与其相似。

3.3 菌株组间关系对大鼠脂代谢相关基因表达的影响

机体内的脂质代谢是通过多种基因共同作用来实现动态平衡的，CYP7A1参与胆固醇分解和胆汁酸合成(Ge等，2022)，FAS参与脂肪酸的合成(Ginenc等，2022)。益生菌可上调CYP7A1基因的表达(高媛等，2023)，且有研究表明，乳酸菌和酵母菌之间存在代谢互补机制(高丽，2023)。在本试验中，与互抑菌组相比，饲粮中添加互促菌组使CYP7A1基因表达水平显著上调(P<0.05)，说明J05和Y21在大鼠试验中表现出协同作用，促进两个菌群的生长，导致CYP7A1基因表达水平上调，促进大鼠体内胆固醇的转化，进而降胆固醇。反之，与对照组和互促菌组相比，饲粮中添加互抑菌组使大鼠CYP7A1基因表达水平显著下调(P<0.05)，说明互抑菌组可能使大鼠肝脏胆汁酸重吸收增加，从而下调胆汁酸经典合成途径(高媛，2023)。因此，在食品工业中，乳酸菌和酵母协同发酵能够有效提升食品的感官品质、食用价值及贮藏特性(兰沁洁，2023；孙磊，2022；张凡凡，2018)，本试验互配机理与之相同，结果相似。此外，与对照组和互抑菌组相比，饲粮中添加互促菌组使 FAS基因表达水平显著上调(P<0.05)，说明互促菌组中乳酸菌和酵母菌的共生作用可能会增加活菌数，促进大鼠肝脏中FAS 基因的表达，使得脂肪酸合成酶的活性增加，机体合成脂肪酸的能力增强，从而导致大鼠体内脂肪的累积。由于本试验研究大鼠脂代谢的相关基因较少，因此在后期还需要在此机制上进一步深入研究，为菌株复筛及其在动物生产上的应用提供理论基础。

参考文献：略

作者：李媛，周冰冰等2025-03-03网络首发于《中国饲料》