芽孢杆菌对断奶前荷斯坦犊牛生长性能、营养物质表观消化率、血清指标和腹泻率的影响

摘要：本试验旨在研究芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)对断奶前荷斯坦犊牛生长性能、营养物质表观消化率、血清指标和腹泻率的影响，以期为应用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌更好地培育健康犊牛提供理论依据。本试验采用完全随机区组设计，选取24头体重为(38.09±1.35)kg的健康初生荷斯坦母犊牛，根据犊牛出生时间分为6个区组，每个区组4头犊牛，分别为对照组(饲喂牛奶+开食料)和芽孢杆菌组(饲喂牛奶+lg/d的芽孢杆菌+开食料)各2头。犊牛在56日龄进行断奶并结束试验。结果表明；与对照组相比，56日龄时，芽孢杆菌组犊牛的体高有下降的趋势(P=0.06)，干物质(P=0.08)和粗蛋白质(P=0.05)表观消化率有升高的趋势，血清免疫球蛋白G含量显著升高(P<0.05)，血清总抗氧化能力(P=0.08)和白蛋白含量(P=0.09)有升高的趋势；28～56日龄时，芽孢杆菌组犊牛的粪便异常天数有下降的趋势(P=0.09)。由此可见，饲喂芽孢杆菌对犊牛生长性能无显著影响，但一定程度上提高了断奶前犊牛的免疫水平和抗氧化能力及犊牛对饲粮干物质和粗蛋白质的表观消化率，同时降低了犊牛腹泻天数。

关键词：芽孢杆菌；荷斯坦犊牛；生长性能；血清指标；腹泻

在传统的畜禽生产中，抗生素是被广泛用作饲料添加剂的生长促进剂。然而，过度使用抗生素会导致许多问题，会使动物产生抗生素耐药性，破坏其肠道微生物系统的平衡。随着对抗生素负面影响的日益关注，许多国家已经禁止或限制在饲料中使用抗生素，我国也在2020年发布了饲料中全面禁止添加抗生素的文件。因此，找寻在动物生产中行之有效的抗生素替代物意义重大。

益生菌作为一种活的微生物，在被人类和动物食用后，能增强免疫力，且不会产生抗药性和药物残留，是抗生素有效替代品之一。其中，芽孢杆菌(Bacillus)是一种孢子形成的细菌，由于其内孢子能够在干燥、消毒剂、酸处理和热处理(包括超高温处理)中存活。因此，它更有可能在恶劣的条件下生存和发挥作用。据报道，口服芽孢杆菌可以提高畜禽生长性能、饲料效率和免疫反应。已有研究表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可以减少家禽肠道中的病原体。也有报道称，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)可用于生产抗病原体的细菌素，改善肠道菌群的平衡，提高动物饲料的营养价值。越来越多的研究表明，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是安全的可食用菌，是抗生素的有效替代品。奶业是一个国家强健民族不可或缺的产业，奶牛养殖业作为奶业的上游产业，决定着奶业的发展方向。而奶犊牛的饲养管理在奶牛生产阶段至关重要，直接决定成年奶牛生产性能是否可以最大程度地发挥出来。因此，保证犊牛健康良好的生长是牧场饲养的主要目标，更是奶牛场持续发展的根基。幼龄时期犊牛免疫力低下，易发生腹泻等肠道健康问题，饲喂芽孢杆菌对犊牛的生长性能以及健康状况是否有影响有待进一步研究。因此，本试验以断奶前荷斯坦犊牛为试验动物，研究芽孢杆菌对犊牛生长性能、营养物质表观消化率、血清指标和腹泻率的影响，旨在为芽孢杆菌作为抗生素替代品在犊牛饲养中科学、健康、合理地应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

本试验于2021年10月至2022年1月在黑龙江省哈尔滨市双城区幸福乡久援村雀巢奶牛养殖培训中心(东经125°41’，北纬45°08')进行。试验中犊牛疾病的治疗按照雀巢奶牛养殖培训中心的标准操作程序进行。所有动物试验操作均按照东北农业大学动物保护委员会的原则和操作指南进行(编号；NEAU-[2011]-9)。

1.2 试验材料

试验所用芽孢杆菌为复合芽孢杆菌，粉状，其中枯草芽孢杆菌活菌数≥1.6×109CFU/g，地衣芽孢杆菌活菌数≥1.6×109CFU/g。

1.3 试验设计

本试验采用完全随机区组设计，选取24头体重为(38.09±1.35)kg的健康初生荷斯坦母犊牛，根据犊牛出生时间分为6个区组，每个区组4头犊牛，分别为对照组(饲喂牛奶+开食料)和芽孢杆菌组(饲喂牛奶+1g/d的芽孢杆菌+开食料)各2头。每个区组的犊牛从出生开始试验到该区组试验结束时长为56 d，在最后1个区组犊牛达到56日龄时，试验结束，试验总天数为78 d。

1.4 饲养管理

犊牛出生后2h灌服初乳4L，12h后再次灌服初乳2L，在整个研究过程中，采用阶梯式递增/减的牛奶喂养方案(第2～7天每天4L牛奶，第8～14天每天6L牛奶，第15～21天每天8L牛奶，第 22～28天每天10L牛奶，第29～35天每天8L牛奶，第36～42天每天6L牛奶，第43～49天每天4L牛奶，第50～56天每天2L牛奶)，每天饲喂2 次(07；30和16；00)。牛奶经72℃高温15s巴氏消毒后，冷却至37～40℃再进行饲喂，芽孢杆菌通过添加在牛奶中摇匀饲喂犊牛。犊牛从出生后便提供自由饮水，15日龄后开始提供开食料(开食料购自科菲特饲料有限公司)，并进行自由采食。每周采集开食料和牛奶样本，-20℃冻存，并于试验结束后混合，测定其营养成分，牛奶和开食料营养水平见表1。整个试验期间，犊牛按照牧场常规饲养管理，定期更换稻草和消毒。

表1 牛奶和开食料营养水平

1.5 样品采集及指标测定

1.5.1 生长性能的测定

称量每头犊牛1、28和56日龄的体重，计算平均日增重；每天记录犊牛的投料量和剩料量，计算开食料采食量和干物质采食量；根据干物质采食量和平均日增重计算饲料转化率。称量犊牛1、28和56日龄的体高、体斜长、臀高、腰围、腹围、管围。

1.5.2 营养物质表观消化率的测定

在犊牛56日龄时采用直肠取粪法收集每头牛的粪样，每隔8h收集1次粪样，持续3d。在采样期间执行严格的卫生条件，将污染降至最低。以酸不溶灰分(AIA)为内标指示物，估算全消化道营养物质表观消化率。将每头犊牛相同时期的单个粪便样本混合，在55℃干燥72h，然后在研磨机中研磨至通过1mm筛子，制备成风干样品，分装于自封袋中，一份样品用于测定粪便中干物质(DM)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量；另一份样品按每0.2mL/g加入浓度为10%的硫酸(H2SO4)，保存粪便中的氨氮，分装于无菌自封袋中，并保存在-20℃冰箱中，用于测定粗蛋白质(CP)含量。

开食料和粪样的DM、CP、粗灰分(Ash)、EE含量按照官方分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)的方法可进行测定，NDF、ADF含量使用Ankom220纤维分析仪(Ankom 公司，美国)按照Van Soest等的方法测定。开食料的总能使用氧弹量热仪(Parr6300，美国)测定，钙(Ca)含量按照GB/T 6436--2018测定，磷(P)含量按照GB/T 6437-2018 测定。使用开食料中的AIA作为内部标记物来计算营养物质表观消化率。在东北农业大学动物营养实验室对牛奶样品中的营养成分进行测定，使用全自动近红外牛奶分析仪(MilkoScan， Foss Electric公司，丹麦)测定牛奶中乳蛋白、乳脂、乳固形物和乳糖含量。

1.5.3 血清生化指标测定

在犊牛1、28和56日龄晨饲前，用肝素钠采血管采集血液，将采集后的血液2000×g离心15 min，收集血清分装于10个1.5mL离心管中，-20℃下冻存待测。血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHOL)、尿素氮(UN)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量及丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)活性在东北农业大学动物科学技术学院使用全自动血液生化仪(URIT-8021Avet，桂林优利特电子集团有限公司)进行测定，试剂盒购自桂林优利特电子集团有限公司。采用酶联免疫吸附测定法测定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量，采用比色法(分光光度法)测定血清总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性，测定仪器为酶标分析仪(DR-200BS，无锡华卫德朗仪器有限公司)，由北京华英生物科技有限责任公司协助检测。

1.5.4 腹泻及治疗情况的测定

从犊牛出生开始，由1名固定的经过培训的评分员于每天晨饲前对每头犊牛的粪便进行评分，粪便评分标准见表2。粪便评分大于等于3分判断为不良，粪便不良天数连续大于等于3d认定为腹泻。粪便异常天数是指粪便评分大于等于3分的天数，腹泻次数是粪便连续大于等于3d判定为不良的次数，抗生素治疗次数是对犊牛使用抗生素药物的次数。根据收集的数据计算2组犊牛的粪便异常天数、腹泻次数及抗生素治疗次数。

表2 粪便评分标准

1.6 数据统计分析

本试验生长性能、体尺及血清生化指标数据运用SAS 9.4软件包中的PROC MIXED模型程序进行分析，其中对体重、体尺及血清生化指标数据的分析包括初始数据(犊牛1日龄时)作为协变量以消除个体差异。数据显著性检验采用最小二乘法，P<0.05表示差异显著，0.05≤P<0.10表示有变化趋势，P>0.10表示差异不显著，结果用平均值和均值标准误(SEM)表示。

2 结果

2.1 芽孢杆菌对犊牛生长性能的影响

由表3可见，2组之间犊牛的开食料采食量、体重、平均日增重、干物质采食量和饲料转化率差异不显著(P>0.10)。29～56日龄时，芽孢杆菌组犊牛的饲料转化率在数值上比对照组有所增高。

表3 芽孢杆菌对犊牛生长性能的影响

由表4可见，与对照组相比，芽孢杆菌组犊牛的体高在56日龄有下降的趋势(P=0.06)，2组之间犊牛的体斜长、胸围、腹围、臀高和管围差异不显著(P>0.10)。

表4 芽孢杆菌对犊牛体尺指标的影响

2.2 芽孢杆菌对犊牛营养物质表观消化率的影响

由表5可见，2组之间犊牛的NDF和ADF表观消化率差异不显著(P>0.10)。与对照组相比，56日龄时，芽孢杆菌组犊牛的DM(P=0.08)和CP(P=0.05)表观消化率有升高的趋势。

表5 芽孢杆菌对犊牛营养物质表观消化率的影响

2.3 芽孢杆菌对犊牛血清指标的影响

2.3.1 芽孢杆菌对犊牛血清免疫和抗氧化指标的影响

由表6可见，与对照组相比，56日龄时，芽孢杆菌组犊牛的血清IgG含量显著升高(P<0.05)，血清T-AOC有升高的趋势(P=0.08)。2组之间犊牛的28和56日龄血清IgA、IgM、MDA含量及SOD、GSH-Px、CAT活性差异不显著(P>0.10)。

表6 芽孢杆菌对犊牛血清免疫和抗氧化指标的影响

2.3.2 芽孢杆菌对犊牛血清生化指标的影响

由表7可见，与对照组相比，56日龄时，芽孢杆菌组犊牛的血清ALB含量有升高的趋势(P=0.09)。2组之间犊牛的28和56日龄血清TP、GLB、GLU、UN、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C含量及ALT、AST、ALP、LDH活性差异不显著(P>0.10)。

表7 芽孢杆菌对犊牛血清生化指标的影响

2.4 芽孢杆菌对犊牛腹泻及治疗情况的影响

由表8可见，2组之间犊牛的粪便评分、腹泻次数和抗生素治疗次数差异不显著(P>0.10)。与对照组相比，28～56日龄时，芽孢杆菌组犊牛的粪便异常天数有下降的趋势(P=0.09)。

表8 芽孢杆菌对犊牛腹泻状况的影响

3 讨论

3.1 芽孢杆菌对犊牛生长性能和营养物质表观消化率的影响

断奶前犊牛的健康生长直接影响犊牛后期的生长发育及成年后的生长性能，体重是评价犊牛生长性能和健康状况的重要指标。但本试验中，所有犊牛平均日增重较低，这可能是由于牛奶的限制性饲喂以及开食料采食量过低所导致的。在崔梓琪的试验中，2组断奶前荷斯坦犊牛的平均日增重为510和590g/d，这与本试验犊牛平均日增重数值相似。在本试验中，并没有发现在体重、干物质采食量、饲料转化率和平均日增重方面有明显差异。Zhang等研究发现，口服补充植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌并不影响荷斯坦犊牛的干物质采食量和体重，与本试验结果一致。Kowalski等则观察到饲喂添加地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌孢子的代乳粉和开食料的小牛体重比对照组小牛体重在试验结束后约增加2.9kg，与本试验结果不同的原因可能是在开食料里添加芽孢杆菌可能会有更好的效果。从数值上看，芽孢杆菌组犊牛在1～28日龄的生长速度低于对照组犊牛，但在29～56日龄的生长速度高于对照组犊牛，说明在本试验的饲喂条件下，芽孢杆菌对犊牛有增重的潜力。体尺可以反映犊牛的生长性能和发育情况，也可以用来预测牛的环境适应能力和潜在的生长性能。在本试验中，芽孢杆菌组犊牛的56日龄体高比对照组低。在Wang 等1]的研究中也发现了类似的情况，饲喂高剂量和低剂量含有芽孢杆菌的组合益生菌组的犊牛体高比对照组犊牛体高低约2.1cm。

在本试验中，牛奶中添加芽孢杆菌饲喂犊牛，提高了DM和CP表观消化率。这可能是由于芽孢杆菌进入消化道后，分泌出高活性的蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、α-淀粉酶等细胞外酶，这些酶可以直接提高饲粮中营养物质的消化率。类似地，单胃动物研究结果表明，添加枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的复合物可以提高断奶仔猪对饲粮中DM和CP的消化率。另外，枯草芽孢杆菌的饲喂效果也可能因畜禽种类、性别、健康状况、环境、饲料成分和益生菌菌种等的不同而有所差异，如在多浪羊的基础饲粮中分别添加3.2×109、3.2×1010、3.2×1011CFU/g的枯草芽孢杆菌，DM、CP、ADF、NDF表观消化率都有所增加；但在湖羊的基础饲粮中添加0.1g/kg的枯草芽孢杆菌菌粉，对DM、CP、ADF、NDF表观消化率无显著影响；将富硒酵母和枯草芽孢杆菌同时添加到湖羊饲粮中，显著增加了DM、CP、ADF、NDF表观消化率。

3.2 芽孢杆菌对犊牛血清指标的影响

3.2.1 芽孢杆菌对犊牛血清免疫指标的影响

犊牛出生前，由于母体胎盘的特殊结构，导致母体的免疫球蛋白不能输送到犊牛的血液系统中，出生后，犊牛的免疫系统发育不完善，免疫力低下，此时的犊牛很容易被病菌感染而发病，只能依靠初乳中的免疫球蛋白及营养物质获得被动免疫，对其免疫系统的建立发挥重要作用。IgG、IgA和IgM作为机体免疫功能中的3种重要抗体，是由淋巴B细胞增殖分化产生的具有抗体活性的免疫球蛋白，可以保护机体免受各种病原微生物的侵害。对抵抗病毒入侵、提高巨噬细胞的吞噬功能、维持犊牛健康状态起到重要的作用。在本研究中，2组犊牛出生时血清免疫指标没有明显差异，但芽孢杆菌组的血清IgG含量在犊牛56日龄时较对照组显著增加。这可能是由于在饲粮中添加芽孢杆菌产生了抗芽孢免疫反应，从而刺激了IgG含量的提高。在 Duc 等的试验中，发现给予枯草芽孢杆菌的小鼠血清IgG含量增加。饲喂犊牛以芽孢杆菌为基础的益生菌，会诱发系统中免疫调节特性，包括免疫刺激以控制病原体、免疫调节以控制炎症以及增强细胞介导的免疫力。

3.2.2 芽孢杆菌对哺乳犊牛血清抗氧化指标的影响

氧化应激是指体内抗氧化剂和自由基的相对平衡，产生各种活性氧(超氧化物、过氧化氢等)，活性氧的利用会对RNA、DNA、蛋白质、脂质和其他生物大分子产生不利影响，产生大量的MDA，导致细胞损伤和死亡。SOD、GSH-Px、CAT和其他抗氧化酶的产生是为了去除多余的活性氧，从而保持健康和稳定的状态，MDA是氧化应激的产物，是衡量脂质过氧化强度的一个指标。本试验中，在犊牛56日龄时，芽孢杆菌组的血清T-AOC 有升高的趋势，表明芽孢杆菌可能改善了犊牛的抗氧化能力。Xu等在用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌饲养肉鸡的过程中也发现了类似的结果。

3.2.3 芽孢杆菌对哺乳犊牛血清生化指标的影响

血清生化指标反映了犊牛机体内的新陈代谢水平。本试验中，与对照组相比，芽孢杆菌组犊牛血清ALB含量有增加的趋势。ALB在维持血浆渗透压和为动物机体提供蛋白质方面起着直接作用，较高的ALB含量表明动物机体的新陈代谢增强。这也可能是芽孢杆菌通过抑制病原体的生长，减少蛋白质分解为氮气(N₂)，从而降低饲粮蛋白质的利用率，提高营养物质的吸收率，进而改善饲粮蛋白质的使用。GLU是衡量机体内能量平衡与否的常用指标，也可直观体现动物对糖的利用情况。本试验中，芽孢杆菌组与对照组犊牛血清GLU含量无显著差异，说明芽孢杆菌对犊牛能量的供给无影响。这与王庆的试验结果相似，即给犊牛饲喂含有枯草芽孢杆菌的饲粮并不影响血清GLU含量。血清CHOL和TG含量可以反映犊牛机体脂类代谢是否正常，LDL-C可以携带运输CHOL，而HDL-C有助于清除细胞内的CHOL。ALT、AST、ALP是机体蛋白质代谢过程中有着重要作用的3种转氨酶，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，当机体蛋白质分解代谢过快时，这3种转氨酶的活性会增加，即血清ALT、AST、ALP活性会增加，其中ALT 和 AST大量分布在肝细胞内，ALP主要在肝脏及骨骼中产生。本试验的2组之间血清ALT、AST、ALP活性没有显著差异，但随着年龄的增长，犊牛血清ALT、AST活性增加。这可能是随着犊牛机体的生长发育，小肠对营养物质的吸收也逐步加强，进入血液中的氨基酸也增加，从而促进心肌中蛋白质的代谢，引起转氨酶活性的增加。LDH活性反映了动物机体能量代谢是否正常，其在糖代谢过程中促进丙酮酸产生乳酸。本试验中，犊牛血清LDH活性随日龄增长而增加，这可能是犊牛在56日龄时因饲喂奶量减少，导致犊牛有一定的断奶应激，机体摄入能量不足，为保证大脑、心脏等重要器官的供氧，其他组织可能会在缺氧条件下进行无糖酵解，从而引起机体LDH活性增加。

3.3 芽孢杆菌对犊牛腹泻率及治疗情况的影响

犊牛是牧场的未来，犊牛阶段的健康对牧场的发展起着至关重要的作用。腹泻是犊牛最常见的疾病之一，它是由肠道平衡的变化和致病菌的增殖引起的，可能导致犊牛的生长性能下降甚至死亡。从粪便评分结果的数值来看，使用芽孢杆菌的犊牛比普通犊牛的粪便评分低，腹泻次数少，这可能是因为芽孢杆菌加速了犊牛胃肠道菌群的建立，促进了消化系统的完善，从而提高了饲料转化率，减少了营养性腹泻，这也说明芽孢杆菌具有改善犊牛健康状况的作用。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌并不是胃肠道中的原始菌群，所以这些无害孢子的存在可能会剌激机体的免疫系统。此外，据报道，用补充芽孢杆菌的电解质治疗小牛，可以减少腹泻的复发，并降低牛粪中梭状芽孢杆菌的数量。

4 结论

牛奶中添加芽孢杆菌对荷斯坦犊牛生长性能无显著影响，一定程度上可以提高犊牛对饲粮DM和CP的表观消化率，增强断奶前犊牛的免疫水平和抗氧化能力，降低犊牛的腹泻天数。

参考文献：略。

作者：程传腾、邹郑欣等发表于《动物营养学报》2024年第9期。