凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡生长性能及肠道消化与吸收功能的影响

 

摘要：本试验旨在研究凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡生长性能及肠道消化与吸收功能的影响。选择320只28日龄健康爱拔益加(AA)肉公鸡，随机分为5个组，每组8个重复，每个重复8只。常温对照组(TC组)肉鸡饲养于(22±1)℃的常温环境，饲喂基础饲粮；热应激组(HS组)肉鸡饲养于(34±l)℃的高温环境，饲喂基础饲粮；热应激试验组肉鸡饲养于(34±l)℃的高温环境，分别饲喂在基础饲粮中添加0.2×107(HS-BC02组)、1.0×107(HS-BC1.0组)、5.0×107CFU/g(HS-BC5.0组)凝结芽孢杆菌的试验饲粮。试验期14d。结果表明：与TC组相比，HS组的末重、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)，干物质和粗蛋白质表观代谢率，空肠食糜总淀粉酶和总蛋白酶酶活，空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度以及空肠钠/葡萄糖协同转运蛋白1(SGLT1)、基础氨基酸转运载体(r-BAT)、y+L氨基酸转运载体-l(y+LATl)mRNA表达量均显著降低(P<0.05)，料重比(F/G)显著增加(P<0.05)。与HS组相比，HS-BC1.0和HS-BC5.0组的ADG、粗蛋白质表观代谢率、空肠绒毛高度/隐窝深度以及空肠SGLTI、r-BAT、y+LATlmRNA表达量均显著增加(P<0.05)，HS-BC1.0组的空肠绒毛高度显著增加(P<0.05)，HS-BC5.0组的空肠食糜总蛋白酶和总淀粉酶活性显著增加(P<0.05)。综上所述，饲粮中添加凝结芽孢杆菌通过提高肠道消化酶活性和促进肠道营养吸收转运载体的表达，改善了热应激肉鸡的生长性能。

关键词：凝结芽孢杆菌；热应激：肉鸡：生长性能：消化吸收

热应激肉鸡最直观的表现是采食量和增重的下降及料重比(F/G)的上升，严重影响了肉鸡生长性能及养殖经济效益。大量科学试验显示，包括凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)在内的多种饲用益生菌对热应激肉鸡的生长性能有不同程度的改善效果，其作用机制包括抗氧化、增强机体免疫及缓解肠道损伤等。此外，少量试验文献发现饲用益生菌能够改善热应激肉鸡对饲料营养物质的表观代谢率，然而很少有研究从肠道营养的消化与吸收领域较为系统地揭示其作用机制，具体表现在2个方面：其一，营养物质的消化取决于肠道整体消化酶的活性，然而饲用益生菌分泌外源消化酶的效果及其对热应激肉鸡肠道消化酶活性影响的研究较少；其二，营养物质的吸收不仅受肠道吸收面积的影响，同时受到肠上皮细胞的多个葡萄糖、氨基酸转运载体蛋白的调控，然而有关饲用益生菌对热应激肉鸡肠道营养转运载体的研究较少。

凝结芽孢杆菌是我国农业农村部《饲料添加剂品种目录》规范使用的饲用益生菌之一。本课题组前期研究表明，饲粮中添加l×107CFU/g凝结芽孢杆菌通过缓解热应激肉鸡的氧化应激及炎症反应，改善了生长性能。基于以上分析及良好的前期工作基础，本试验通过在饲粮中添加不同水平的凝结芽孢杆菌，研究凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡营养物质表观代谢率、消化酶活性、肠道形态以及肠道关键葡萄糖、氨基酸转运载体蛋白mRNA表达的影响，以期从饲料营养的消化与吸收角度较为系统地揭示凝结芽孢杆菌改善热应激肉鸡生长性能的作用机制，为凝结芽孢杆菌在肉鸡养殖生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

按体重相近原则将320只28日龄健康爱拔益加(AA)肉公鸡随机分为5个组，每组8个重复，每个重复8只。常温对照组(TC组)肉鸡饲养于(22±l)℃的常温环境，饲喂基础饲粮；热应激组(HS组)肉鸡饲养于(34±l)℃的高温环境，饲喂基础饲粮；热应激试验组肉鸡饲养于(34±l)℃的高温环境，分别饲喂在基础饲粮中添加0.2×107(HS-BC0.2组)、1.0×107(HS-BC1.0组)、5.0×107 CFU/g(HS-BC5.0组)凝结芽孢杆菌的试验饲粮。试验用凝结芽孢杆菌制剂(总菌数5.0×1010 CFU/g，菌株编号YNAU5517)由课题组制备。

1.2 试验饲粮和饲养管理

饲粮参考《鸡饲养标准》(NY/T33-2004)配制，基础饲粮组成及营养水平见表1，饲粮中不添加抗生素、饲用益生菌、酸化剂等功能性添加剂。所有试验饲粮均为颗粒料(80℃制粒)。

表1基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

 

1)预混料为每千克饲粮提供：VA 10000 IU， VD3 3500IU，VE 25 mg， VK 2.0 mg，VB1 2.0 mg，VB2 6.0mg，VB6 4.0 mg，叶酸1.0 mg，烟酸40 mg，泛酸1l mg，生物素0.15 mg，Cu 8 mg，Fe 80 mg， Mn 100 mg，Se 0.30 mg，I 0.35 mg，Zn 75 mg，胆碱800 mg。

2)代谢能为计算值，其余为实测值。

试验在云南农业大学试验鸡场的2间温控鸡舍进行，鸡舍规格为长×宽×高=7.7m×4.2m×2.4m，2间鸡舍环境温度分别为(22±l)℃和(34±l)℃。鸡舍由电控锅炉供暖、循环风控温，试验期间24h维持2间鸡舍温度。试验鸡为笼养方式，笼架为4层设计，共32个笼，单笼规格为长×宽×高=140 cm×70 cm×32cm。试验期间自由采食、饮水，24h光照。试验期14d。

1.3 样品采集与指标检测

1.3.1 样品采集及制备

42日龄时，所有试验鸡称重后，每组以重复为单位随机屠宰1只鸡。取空肠食糜，于-20℃保存，用于总蛋白酶和总淀粉酶活性的测定；取3～4cm空肠组织，于4%多聚甲醛固定，用于肠道形态的测定；取1cm空肠组织，立即转入液氮，随后-80℃保存，用于葡萄糖和氨基酸转运载体mRNA表达量的测定。

1.3.2 生长性能

28和42日龄时，测定试验鸡体重，计算初重和末重。试验期间记录采食量，计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和F/G，以组为单位计算死淘率(死淘鸡数占总鸡数的百分比)。

1.3.3 营养物质表观代谢率

收集试验鸡39～41日龄3d的排泄物，将排泄物上的羽毛、皮屑和饲料等挑除，称重后按10%的比例加入浓度为10%的盐酸，将收集3d的排泄物混合制成风干样，粉碎过40目筛密封保存，用于饲料营养物质表观代谢率的测定，具体操作及检测方法参考Rodjan等。

1.3.4 肠道食糜消化酶活性

使用对应试剂盒，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法(HBS-1101型酶标分析仪，南京德铁实验设备有限公司)在450nm波长下检测空肠食糜总蛋白酶和总淀粉酶活性，操作方法按照说明书进行。总蛋白酶(试剂盒编号：YJ023854)和总淀粉酶(试剂盒编号：YJ035633)试剂盒购买于上海酶联生物科技有限公司。

1.3.5 凝结芽孢杆菌菌株产酶性能

挑取凝结芽孢杆菌的单个菌落接种至MRS培养基中，于恒温振荡培养箱(37.5℃、180r/min)培养24h，制备菌液样品。随后，取25 mL菌液离心(8000r/min、15 min)，获得上清液样品。

使用对应试剂盒，采用ELISA法(HBS-1101型酶标分析仪，南京德铁实验设备有限公司)在450nm波长下检测凝结芽孢杆菌的菌液和上清液总蛋白酶和总淀粉酶活性。总蛋白酶(试剂盒编号：YJ036698)和总淀粉酶(试剂盒编号：YJ056987)试剂盒购买于上海酶联生物科技有限公司。

1.3.6 肠道形态

肠道形态的检测采用苏木红-伊红(HE)染色法，参照课题组前期报道。简述如下，将甲醛固定好的空肠组织经过脱水、石蜡包埋、切片、HE染色处理，再脱水封片。切片用光学显微镜镜检，每张切片观测10～20根连续的肠绒毛，用Case Vie-wer软件测量绒毛高度、隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度。

1.3.7 肠道组织葡萄糖和氨基酸转运载体mRNA表达量

采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)法检测空肠钠/葡萄糖协同转运蛋白1(sodium-glucose co-transporter1，SGLTI)、钠/葡萄糖协同转运蛋白2(sodium-glucose co-transporter 2，GLUT2)、基础氨基酸转运载体(basic amino acid transporter，r-BAT)、y+L氨基酸转运载体l( y+L amino acid transporter l，y+LATI)以及阳离子氨基酸转运载体-1(cationic amino acid transporter l，CAT-1)的mRNA表达量。按照试剂盒方法提取组织样品总RNA，将总RNA反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR。采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA表达量，内参基因为β-肌动蛋白(β-actin)。引物设计参考Sun 等，引物序列见表2。

表2 引物序列

 

1.4 数据统计分析

试验数据使用SPSS 21.0统计软件分析进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较，数据以平均值和均值标准误(SEM)表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡生长性能的影响

由表3可知，与TC组相比，HS组的末重、ADG和ADFI显著降低(P<0.05)，F/G显著增加(P<0.05)。与HS组相比，HS-BC1.0和 HS-BC5.0组的ADG显著增加(P<0.05)；HS-BC0.2、HS-BC1.0和HS-BC5.0组的F/G均降低，但差异不显著(P>0.05)。此外，HS组和HS-BC0.2组的死淘率较高，分别为17.19%和15.63%，而TC组和HS-BC5.0组的死淘率为0。

2.2 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡营养物质表观代谢率的影响

由表4可知，与TC组相比，HS组的干物质和粗蛋白质表观代谢率显著降低(P<0.05)。与HS组相比，HS-BC1.0和HS-BC5.0组的粗蛋白质表观代谢率显著升高(P<0.05)，HS-BC0.2组的粗蛋白质表观代谢率差异不显著(P>0.05)；HS-BC0.2、HS-BC1.0和HS-BC5.0组的干物质表观代谢率差异不显著(P>0.05)。

 

表3凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡生长性能的影响

 

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

表4凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡营养物质表观代谢率的影响

 

2.3 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡空肠食糜消化酶活性的影响

由表5可知，与TC组相比，HS组的空肠食糜总淀粉酶和总蛋白酶活性显著降低(P<0.05)。与HS组相比，HS-BC5.0组的空肠食糜总淀粉酶和总蛋白酶活性显著增加(P<0.05)，HS-BC2.0和HS-BC1.0组的空肠食糜总淀粉酶和总蛋白酶活性差异不显著(P>0.05)。

表5凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡空肠食糜消化酶活性的影响

 

2.4 凝结芽孢杆菌菌株产酶性能的体外检测

由图1可知，凝结芽孢杆菌培养菌液及其离心上清液中均含有淀粉酶和蛋白酶，且上清液中总淀粉酶和总蛋白酶活性均显著高于菌液(P<0.05)。

 

 

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

图1凝结芽孢杆菌菌株产酶性能的体外检测

2.5 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡空肠形态的影响

由表6可知，与TC组相比，HS组的空肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度显著降低(P<0.05)，空肠隐窝深度差异不显著(P>0.05)。与HS组相比，HS-BC1.0组的空肠绒毛高度显著升高(P<0.05)，HS-BC0.2和HS-BC5.0组的空肠绒毛高度差异不显著(P>0.05)；HS-BC0.2、HS-BC1.0和 HS-BC5.0组的空肠隐窝深度差异不显著(P>0.05)；HS-BC1.0和HS-BC5.0组的空肠绒毛高度/隐窝深度显著升高(P<0.05)，HS-BC0.2组的空肠绒毛高度/隐窝深度差异不显著(P>0.05)。

表6凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡空肠形态的影响

 

2.6 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡空肠葡萄糖及氨基酸转运载体mRNA表达量的影响

由图2可知，与TC组相比，HS组的空肠SGLT1 mRNA表达量显著降低(P<0.05)。与HS组相比，HS-BC1.0和HS-BC5.0组的空肠 SGLTI mRNA表达量显著增加(P<0.05)，HS-BC0.2组的空肠SGLT1 mRNA表达量差异不显著(P>0.05)。各组之间空肠GLUT2mRNA表达量差异不显著(P>0.05)。

 

 

由图3可知，与TC组相比，HS组的空肠r-BAT和 y+ LATl mRNA表达量显著降低(P<0.05)。与HS组相比，HS-BC1.0和HS-BC5.0组的空肠r-BAT mRNA表达量显著增加(P<0.05)，HS-BC0.2组的空肠r-BAT mRNA表达量差异不显著(P>0.05)；HS-BC0.2、HS-BC1.0和HS-BC5.0组的空肠 y+LATl mRNA表达量均显著升高(P<0.05)。各组之间空肠CAT-l mRNA表达量差异不显著(P>0.05)。

 

 

3 讨论

3.1 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡生长性能的影响

本试验结果显示，与TC组相比，HS组的末重、ADG、ADFI显著降低，表明热应激严重降低肉鸡生长性能，这与大量的前人报道一致。王乙茹等研究显示，与HS组相比，饲粮中添加低水平(0.4×107CFU/g)凝结芽孢杆菌降低了肉鸡F/G，但差异不显著；若凝结芽孢杆菌添加水平提高至1.0×107CFU/g，肉鸡F/G显著降低。与HS组相比，HS-BC0.2、HS-B1.0和HS-BC5.0组的 F/G分别降低了1.82%、6.82%、5.91%，尽管无显著差异，但有下降的趋势。这与王乙茹等的报道基本相符。已有大量的综述与试验报道显示，包括凝结芽孢杆菌在内的多种饲用益生菌对热应激肉鸡的F/G及增重等生长性能指标有不同程度的改善作用。以上生长性能数据综合分析表明，在采食量不变的情况下，饲粮补充中高水平的凝结芽孢杆菌可能通过改善饲料的消化与吸收，进而缓解肉鸡热应激条件下的负面效应。

3.2 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡表观代谢率的影响

本试验结果显示，与TC组相比，HS组的干物质、粗蛋白质表观代谢率显著降低，这与大量的前人报道一致。与HS组相比，HS-BC1.0和HS-BC5.0组的粗蛋白质表观代谢率分别显著提高了5.85%和7.96%，但HS-BC0.2组无显著差异。包括粗蛋白质、干物质等营养物质的表观代谢率直观体现了肉鸡对营养物质的消化与吸收情况，因此以上结果表明凝结芽孢杆菌一定程度上改善了热应激肉鸡对饲料的消化与吸收，尤其提高了蛋白质消化与吸收，这有助于改善肉鸡的增重，也与生长性能的结果相符。已有试验报道，饲用益生菌对热应激肉鸡生长性能及营养物质表观代谢率均有不同程度的改善作用。

3.3 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡肠道食糜消化酶活性的影响

肠道食糜消化酶活性是引起肉鸡营养物质表观代谢率变化的重要原因之一。大量综述与试验表明，热应激导致肉鸡肠道多种消化酶的分泌降低，进而影响肉鸡对营养物质的消化，导致营养物质表观代谢率降低。本研究结果也表明，与TC组相比，HS组的空肠食糜总蛋白酶和总淀粉酶活性分别显著降低了14.44%和13.85%。

本研究还发现，与HS组相比，热应激条件下饲粮中添加5.0×107CFU/g凝结芽孢杆菌的HS-BC5.0组的空肠食糜总蛋白酶和总淀粉酶活性分别显著增加了12.51%和13.39%。已有综述及试验显示，包括凝结芽孢杆菌在内的多种饲用益生菌能够分泌多种消化酶，是畜禽肠道内源酶的重要补充，有助于提高畜禽对营养物质的消化能力，是畜禽生长性能改善的重要机制之一，Wang 等研究报道，与基础饲粮组相比，正常环境温度下饲粮中添加4.0×106CFU/g凝结芽孢杆菌组肉鸡的空肠蛋白酶和淀粉酶活性分别显著提高了21.33%和23.91%。王乙茹等研究也显示，正常环境温度下饲粮中添加凝结芽孢杆菌能够增加肉鸡肠道蛋白酶和淀粉酶活性。由此可见，无论正常环境温度还是热应激条件下，凝结芽孢杆菌增加肠道整体消化酶活性是营养物质表观代谢率提高的重要原因之一，这一作用可能与凝结芽孢杆菌分泌多种消化酶有关。

资英娟等和张韵等采用多种消化酶的指示培养基，采用体外试验定性检测(透明圈法)发现，凝结芽孢杆菌能够胞外分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及纤维素酶。在以上定性研究报道基础上，本研究进一步采用ELISA法定量检测了凝结芽孢杆菌的培养菌液及其离心上清液中总蛋白酶和总淀粉酶活性，结果表明凝结芽孢杆菌的菌液和上清液中均含有淀粉酶和蛋白酶，且上清液中总蛋白酶和总淀粉酶活性均显著高于菌液。

综上所述，饲粮中添加的凝结芽孢杆菌进入肉鸡肠道，分泌了多种消化酶，提高了肉鸡粗蛋白质表观代谢率，这可能是凝结芽孢杆菌提高热应激肉鸡ADG、改善F/G的重要机制之一。

3.4 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡肠道形态的影响

热应激损伤肉鸡肠道形态，降低肠道对营养物质的吸收面积。肠道损伤直观表现为肠绒毛高度下降、隐窝深度增加以及绒毛高度/隐窝深度减小。本研究结果显示，与TC组相比，HS组的空肠肠绒毛高度以及肠绒毛高度/隐窝深度显著降低。肠道形态的变化提示，肠道对营养物质的吸收面积减少是热应激肉鸡营养物质表观代谢率及生长性能降低的另一重要原因。

本研究发现，凝结芽孢杆菌缓解了热应激对肉鸡肠道形态的损伤作用。与HS组相比，HS-BC1.0和HS-BC5.0组的空肠绒毛高度分别增加了9.97%、7.55%，绒毛高度/隐窝深度分别增加了18.89%、13.17%。尽管与TC组相比，饲粮中添加凝结芽孢杆菌组的以上肠道形态学指标未能完全恢复，但这一作用效果提示凝结芽孢杆菌具有维持和/或修复环境热应激引发的肠道损伤，其可能的作用机制包括：1)抑菌功能。热应激引发肉鸡肠道菌群失衡，尤其是致病大肠杆菌、沙门氏菌等肠道有害菌滋生是肠道损伤的重要原因之一。课题组前期多篇体外抑菌试验和动物饲养试验研究表明，凝结芽孢杆菌对致病大肠杆菌、沙门氏菌等畜禽肠道主要有害菌有显著的抑制作用。2)促进肠上皮细胞修复。热应激导致肠上皮细胞损伤，修复更新肠上皮细胞显然需要机体提供大量的蛋白质。依据本研究体内、体外总蛋白酶活性检测结果，推测凝结芽孢杆菌增加了肉鸡肠道蛋白酶活性，这为热应激肉鸡修复更新肠上皮细胞提供了更多的蛋白质营养。

3.5 凝结芽孢杆菌对热应激肉鸡空肠葡萄糖及氨基酸转运载体mRNA表达量的影响

除肠道组织损伤引发营养吸收面积的减少，肠上皮细胞营养转运载体蛋白是影响热应激肉鸡对营养吸收的另一重要原因，其中肠上皮细胞葡萄糖转运载体蛋白SGLT1、GLUT2以及氨基酸转运载体蛋白r-BAT、y+LATl、CAT-1的作用十分关键。SGLT1主要分布在肠上皮细胞膜刷状缘，负责将肠道食糜中单糖转入肠上皮细胞；GLUT2主要分布在肠上皮细胞基底侧膜，负责将肠上皮细胞吸收的单糖转入血液。r-BAT、y+LAT1、CAT-1主要分布在小肠上皮细胞刷状缘和基底膜，隶属非钠离子(Na+)依赖性碱性和中性氨基酸转运系统，对肠道酶解后的氨基酸分子转运吸收发挥关键作用，尤其是与增重相关的赖氨酸、组氨酸、精氨酸等必需氨基酸。已有研究表明，热应激显著降低肉鸡肠上皮细胞SGLT1、r-BAT 和y+LATl mRNA表达量。本研究结果显示，与TC组相比，HS组的空肠SGLT1、r-BAT 和y+LATl mRNA表达量显著降低。

当前，有关饲用益生菌对热应激肉鸡肠上皮细胞营养转运载体蛋白影响的报道较少。Faseleh等研究报道，饲粮中添加1.0×106CFU/g饲用乳酸杆菌上调了热应激肉鸡空肠SGLTlmRNA 表达量。洪奇华等报道显示，饲粮中添加1.2×105CFU/g复合益生菌虽有提高热应激肉鸡肠道r-BAT、y+LATl mRNA表达量的趋势，但差异不显著。本研究结果显示，与HS组相比，饲粮中添1.0×107、5.0×107 CFU/g凝结芽孢杆菌的HS-BC1.0和 HS-BC5.0组的空肠SGLT1、r-BAT、y+LATlmRNA表达量显著提高，但添加0.2×107CFU/g凝结芽孢杆菌的HS-BC0.2组的空肠SGLTI、r-BAT、y+LATlmRNA表达量无显著差异。以上结果表明，饲粮中添加1.0×107、5.0×107CFU/g 凝结芽孢杆菌有效上调了肠细胞营养转运载体蛋白的表达，促进了营养物质的吸收效率，这是凝结芽孢杆菌一定程度改善热应激肉鸡营养物质表观代谢率的另一重要原因。

4 结论

凝结芽孢杆菌通过增加肠道消化酶活性、维持肠道形态、促进肠上皮细胞营养转运载体蛋白表达，提高了热应激肉鸡对饲粮营养物质的消化与吸收能力，从而改善了生长性能，且以1.0×107、5.0×107CFU/g凝结芽孢杆菌添加水平效果较好。

参考文献：略

作者：肖明霞，白华毅等发表于《动物营养学报》2023年第4期。