凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡生产性能、肠道免疫因子及肠道菌群的影响

摘要：试验旨在研究产蛋后期蛋鸡饲粮中添加凝结芽孢杆菌对其生产性能、肠道免疫因子和肠道菌群的影响。选取840只63周龄海兰褐蛋鸡，分为2组，每组10个重复，每个重复42只。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加0.05%凝结芽孢杆菌粉，试验期45d。结果表明：与对照组相比，试验组料蛋比、破蛋率均有所降低，但差异不显著；试验组蛋鸡的蛋形指数及蛋壳厚度均无显著差异；试验组IFN-γ、IL-8和TNF-α基因表达量显著降低；门水平上，对照组拟杆菌门丰度高于试验组(P<0.05)，厚壁菌门丰度低于试验组(P<0.05)；属水平上，试验组拟杆菌属丰度低于对照组(P<0.05)，栖粪杆菌属丰度高于试验组(P<0.05)；普雷沃氏菌、脱硫弧菌属、另枝菌属指标均无显著差异。本试验条件下，饲粮中添加0.05%凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡的生产性能改善作用不显著，但可以通过降低促炎因子的表达来改善机体炎症反应，同时降低致病菌的相对丰度，调节肠道菌群平衡。

关键词：凝结芽孢杆菌；产蛋后期；生产性能；肠道菌群；蛋鸡

动物主要是通过肠道来实现营养吸收，肠道的健康程度被认为是影响家禽生存和生产性能的重要因素。随着年龄的增长，蛋鸡肠道吸收功能急剧下降，产蛋后期蛋鸡生产性能降低、蛋品质下降。提高产蛋后期蛋鸡肠道吸收可间接提高蛋鸡生产性能。近年来，一些研究发现益生菌可以抑制病原菌的定植，维持胃肠道微生物的平衡。饲粮中添加益生菌可通过提高蛋鸡生产性能、降低蛋黄胆固醇和死亡率以及提高机体免疫功能来提高经济效益。凝结芽孢杆菌不仅具有乳酸菌和双歧杆菌的特性，而且耐酸性环境和高温，有利于益生菌在饲料高温制粒过程中保持活性。赵必迁等研究发现，产蛋高峰期饲料中添加凝结芽孢杆菌可显著提高蛋鸡的产蛋率，料蛋比有降低趋势；程志斌等报道，饲粮中添加(0.3～1.0)×106CFU/g饲用凝结芽孢杆菌，可改善蛋鸡生产性能并降低料蛋比，大幅降低蛋鸡的次品蛋率。本研究重点是探究凝结芽孢杆菌对产蛋后期海兰褐蛋鸡生产性能、蛋品质、肠道免疫因子以及肠道菌群等方面的影响，旨在为凝结芽孢杆菌在蛋鸡上应用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1       试验材料

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)菌株由某科技有限公司提供，活菌数≥2×109CFU/g。

1.2       试验设计与饲养管理

选取63周龄、健康状况良好、体重、产蛋率基本一致的海兰褐蛋鸡840只。试验分为2组，每组10个重复，每个重复42只，试验期45d。对照组饲喂基础饲粮，而试验组在基础饲粮基础上添加0.05%凝结芽孢杆菌(饲料中活菌数≥10×105CFU/g)。基础饲粮组成和营养成分见表1。试验采用笼养方式，每日投喂试验料2次以确保采食均衡，产蛋期停用一切药物。每日观察鸡群健康情况与精神状况，试验期间鸡群自由采食和饮水。

表1基础饲粮组成和营养成分(风干基础)

注：①预混料为每千克饲粮提供：铜20mg，铁90mg，锌 90 mg，锰60mg，碘0.65mg，硒0.35mg，维生素A9000IU，维生素D32000IU，维生素E 11IU，维生素K 1.0mg，维生素B2 5.8 mg，烟酸66mg，泛酸10mg，维生素B6 2.6mg，生物素0.10mg，叶酸0.7mg，维生素B12 0.012 mg。②粗蛋白质、粗灰分、钙为实测值。代谢能、总磷、氨基酸均为计算值。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生产性能  

每天14：00定时收集并记录各重复组总蛋数、破蛋数，称量总蛋重，计算各重复产蛋率、破蛋率、蛋重；每2周统计1次采食量，计算料蛋比。

1.3.2 蛋品质  

试验后期(68周龄)检测蛋品质，每个处理固定1个重复随机采集25枚鸡蛋。使用游标卡尺测量蛋样纵径与横径，计算蛋形指数；蛋壳厚度使用蛋壳厚度测定仪(YN-125，南京瑶恩仪器设备有限公司)测定。

1.3.3 肠道免疫因子基因表达  

试验结束后，每个重复随机选择1只体重接近平均体重的蛋鸡，每个处理共选择10只鸡，称重后屠宰，采集回肠中段，平铺于滤纸上，纵向剖开，刮取肠黏膜1g，于-80℃保存，测定黏膜免疫因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)的基因表达量。目标基因IL-1β、TNF-α、IL-8、IFN-γ的引物序列见表2。肠 道 黏膜总RNA使用Trizol试剂(Invitrogen Life Technologies，美国)提取。将组织放到液氮里研磨粉碎，加入1mL Trizo1试剂匀浆后，4℃、12 000 r/min离心15min，取上清液，加入500μL氯仿，混匀，静置5 min，4℃、12 000r/min离心10min；取上清液加入700μL异丙醇，混匀，4℃、12000r/min离心10 min，弃除异丙醇，留白色沉淀物；用75%乙醇轻轻吹打洗涤后，置于超净台风干；加一定体积的DEPC 水溶解，用核酸测定仪(Nano-drop 1000)测定总RNA纯度和浓度后进行反转录。参照SYBR Premix Ex TaqT™(TaKaRa公司，日本)试剂盒说明书进行荧光定量PCR，反应仪器为7500荧光检测系统(Applied Biosystems，美国)。PCR反应条件：90℃预变性30 s；90℃变性5s，60℃复性34 s，40个循环反应。PCR扩增完成后用熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳法分析验证产物的特异性。基因表达的结果采用2-△△CT法进行分析。

表2引物序列号及长度

1.3.4 肠道菌群 

试验鸡处死后采集蛋鸡回肠中段食糜，每个重复1个样品，用无菌冻存管分装，液氮速冻后于-80℃冷冻保存，进行细菌16S rDNA V3+V4高通量测序，包括总DNA提取、PCR扩增和Illumina HiSeq测序及结果分析。采用高通量测序技术，以得到高质量的Tags数据(Clean Tags)，在Tags数据的基础上进行操作分类单元(OTUs)聚类以及物种分类的分析。根据OTUs聚类的结果，对各OTU序列进行物种注释，以获取相对应的物种信息和以物种丰度的基础分布状况。同时，计算OTUs丰度、α-多样性等指标。

1.3       统计分析

微生物多样性采用QIIME2软件进行分析；其他指标数据采用Excel软件对数据进行初步处理，然后用SPSS 22.0统计软件对试验数据进行独立样本t检验。结果以平均值和标准差(SD)表示，P<0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

由表3可知，各组间产蛋率、蛋重、破蛋率、日采食量及料蛋比均无差异(P>0.05)；与对照组相比，试验组料蛋比、破蛋率均有所降低(P>0.05)。

表3凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

2.2  凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

由表4可知，与对照组相比，试验组蛋鸡的蛋形指数和蛋壳厚度均无差异(P>0.05)。

表 4 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

2.3 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道免疫因子表达的影响

由表5可以看出，与对照组相比，试验组IFN-γ、IL-8和TNF-α基因表达量降低(P<0.05)，IL-1β表达量差异不显著。

表5凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道免疫因子表达的影响

2.4 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道菌群的影响

2.4.1 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道α-多样性指数的影响  

由ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数(图1)可见，对照组盲肠内容物菌群丰富度和多样性略高于试验组(P>0.05).

图1 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道微生物α-多样性的影响

2.4.2 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡不同分类水平肠道菌群的影响

由表6可见，试验组拟杆菌门丰度低于对照组(P<0.05)，厚壁菌门丰度高于对照组(P<0.05)，其他菌门组间并无差异(P>0.05)。

表 6凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道菌群门水平相对丰度的影响

由表7可见，在蛋鸡回肠微生物区系属水平上，试验组拟杆菌属丰度低于对照组(P<0.05)，栖粪杆菌属丰度高于对照组(P<0.05)，其他菌属组间均无差异(P>0.05)。

表7凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道菌群属水平

相对丰度的影响

3 讨 论

3.1 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡生产性能和蛋品质的影响   

蛋鸡保持较高的生产性能是获得较高经济效益的关键。产蛋后期受机体退化、多种应激和免疫功能下降等影响，蛋鸡产蛋性能和饲料转化率会降低。饲粮中添加益生菌对动物的肠道健康、机体免疫等有改善作用，同时可以促进营养物质的吸收，可有效改善蛋禽产蛋性能。有研究发现，饲粮中添加凝结芽孢杆菌对蛋鸡、蛋鸭的生产性能具有一定改善作用；Pan等发现，饲粮中添加3.2×109CFU/g地衣芽孢杆菌显著提高了海兰褐蛋鸡产蛋率，降低了料蛋比；赵娜等发现，饲粮中添加2×107CFU/g凝结芽孢杆菌，可显著降低蛋鸡死淘率，但对料蛋比、产蛋率等指标无显著影响；程志斌等研究表明，与未添加凝结芽孢杆菌组相比，(0.3～1.0)×106CFU/g凝结芽孢杆菌组罗曼蛋鸡料蛋比均降低，1.0×106CFU/g凝结芽孢杆菌组料蛋比显著降低4.37%。本研究结果表明，同对照组相比，饲粮中添加凝结芽孢杆菌产蛋后期蛋鸡料蛋比及破蛋率均有降低，但是差异不显著。料蛋比及蛋壳质量提高主要有两方面原因：一方面，凝结芽孢杆菌可加强蛋白质合成代谢，提高钙、磷等营养物质的消化吸收，从而改善蛋壳质量：另一方面，凝结芽孢杆菌在肠道内繁殖，如产生的乳酸可以降低肠道pH，产生的酶促因子等可以促进一些复杂的碳水化合物降解，进而改善机体消化功能。

产蛋后期蛋鸡的蛋壳质量下降，破蛋率升高，影响养殖效益。目前的研究表明，生产中使用凝结芽孢杆菌可提高蛋禽的蛋壳厚度和蛋壳强度。潘兴亮等研究表明，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可改善破蛋率和沙壳蛋率，且平均蛋重、蛋壳强度和哈氏单位等较对照组均有所提高。本研究发现，饲粮中添加凝结芽孢杆菌对鸡蛋蛋形指数和蛋壳厚度无显著影响，但破蛋率略有降低，表明饲粮中添加凝结芽孢杆菌可改善蛋壳质量，一定程度上改善蛋品质。

3.2 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道免疫因子基因表达量的影响

产蛋后期蛋鸡易受多种疾病的侵害，对疾病抵抗力逐渐降低。一般认为，肠道组织损伤是由细菌诱导的炎症因子过度表达造成的。促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等是先天免疫应答后引起代谢级联改变的主要炎症因子。在抵御肠道病原入侵过程中，炎症因子与其他炎症细胞协同发挥了重要作用。IFN-γ能刺激机体产生抗菌活性物质，从而影响宿主免疫细胞活性。当机体中抗炎因子和促炎因子处于动态平衡，动物机体则处于正常健康状态：当肠道发生疾病时，这种动态平衡状态被破坏，促炎因子迅速增多，肠道黏膜屏障受到破坏。李玉鹏等研究发现，在动物饲粮中添加益生菌可通过调节抗炎性因子和促炎性因子的表达，改善动物机体的炎症反应。

本试验结果表明，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可降低蛋鸡肠道黏膜TNF-α、IL-1β和IL-8的表达量。病原微生物可通过Tol1样受体与上皮细胞结合，刺激上皮细胞分泌促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-8等。其中，IL-8可诱导机体发生局部炎症反应，吞噬抗原，启动肠源性系统炎症反应，以此达到杀菌目的。而这一反应会产生更多的促炎细胞因子，过多的促炎因子会与上皮细胞上的受体结合，降低肠上皮细胞间的紧密连接，对肠道黏膜屏障造成损伤。因此，本试验证实了在饲粮中添加凝结芽孢杆菌可以通过降低促炎因子的表达来改善机体炎症反应，有效缓解肠道黏膜损伤。

3.3 凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡肠道微生物区系的影响

肠道内菌群是一个多样化、稳定的生态系统，参与宿主的饲料消化、免疫调节和生长发育等生理过程，影响动物生长和健康。肠道中菌群的多样性以及组成结构受饲粮组成、动物日龄、抗生素、遗传因素、免疫应答功能或者病原体感染等因素影响。

本试验结果表明，饲粮中添加凝结芽孢杆菌提高了厚壁菌门和栖粪杆菌属丰度，降低了肠道中变形菌门和脱硫弧菌属的丰度。厚壁菌门中多数菌属于产丁酸菌，丁酸属于短链脂肪酸，而短链脂肪酸可诱导上皮紧密连接(TJs)的重建，增强肠道屏障完整性，抑制肠黏膜的通透性。据报道，厚壁菌门的增加和变形菌门的降低有益于肠道健康，提高肉鸡的生长性能。有研究发现，凝结芽孢杆菌对大肠埃希氏菌、变形杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌等常见肠道病原菌的生长繁殖有抑制作用，凝结芽孢杆菌在肠道生长过程中，通过消耗肠道中的氧气产生L-乳酸、丙酸、乙酸等有机酸，降低肠道内的pH，可为乳酸菌、双歧杆菌等益生菌提供一个良好的生长环境，也可抑制幽门螺旋菌、大肠杆菌等致病菌的繁殖。脱硫弧菌属是肠道菌群中主要的硫酸盐还原菌，易引起肠炎、肠易激综合征等疾病。厌氧呼吸中的硫酸盐还原菌能够将硫酸盐还原为硫化氢。硫化氢具有抑制丁酸盐氧化的作用，而肠上皮细胞70%以上的能量来源于丁酸盐氧化，当能量不足时，可能会破坏肠壁细胞间紧密连接，导致上皮细胞损伤死亡以及黏膜炎症。本试验中，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可有效阻止病原菌黏附和定植，抑制致病菌的生长，为益生菌创造良好的生长环境，有效调节肠道菌群平衡。

4 结论

本研究结果表明，饲粮中添加0.05%凝结芽孢杆菌对产蛋后期蛋鸡生产性能的改善作用不显著，但可以通过降低促炎因子的表达来改善机体炎症反应，同时降低致病菌的相对丰度，调节肠道菌群平衡。

参考文献：略。

作者：刘永学，蒋梦宇等发表于《中国畜牧杂志》2024年第5期。