乳酸菌的分离鉴定及其微生态制剂功能性初评

 

摘要：通过平板法和PCR法对乳酸菌进行分离鉴定，并对其生物学特性、培养条件进行初步探索，筛选出一株较为优秀的乳酸菌菌株A3，通过动物实验来研究该乳酸菌制剂对蛋鸡的生产性能、蛋品质、血清生化的影响。结果显示，筛选的A3菌株为哈尔滨乳杆菌菌属，具有较强的产酸能力及耐酸能力。在40℃条件下，培养基初始pH为5的培养条件为该菌株最佳培养条件，用该菌株制备的微生态制剂添加到日粮中可以显著降低料蛋比(P<0.05)，改善蛋品质主要表现在蛋壳厚度显著增加(P<0.05)，对于血清生化各项指标虽有一定影响。但差异不显著。结论：A3菌株生物学特性明显，用该菌制备的乳酸菌制剂按0.2%添加使用，对蛋鸡的生产性能、蛋品质、血清生化指标均有一定的改善作用。

关键词：乳酸菌；分离鉴定；生物学特性；微生态制剂

微生态制剂是一种利用微生物或是促进微生物生长的一种活性物质的总称。随着微生物学、分子生物学和基因工程的研究深入，饲用微生物制剂无毒害、绿色、成本低、无耐药性等优点显著。现今研究表明，乳酸菌制剂不仅能够增加分泌菌群代谢产物，刺激肠道上皮细胞排除病原微生物。还可以增加免疫细胞活性、调节细胞因子的产生，以此来调节机体免疫系统。在受到病原菌入侵机体时，乳酸菌制剂可以合成维生素及一些氨基酸来协同机体的先天免疫系统调节免疫反应。物源性乳酸菌易导致畜禽蛋白过敏，造成排斥反应。因此寻找合适的乳酸菌对于饲用微生态制剂发展尤为重要。

1 材料

试验材料

主要试剂：MRS肉汤、猪胆盐、硫代硫酸钠、醋酸铅、革兰氏染液、DNA提取试剂盒。

主要仪器：蒸汽灭菌锅、生化培养箱、光学显微镜、紫外分光光度计、PCR仪。

试验菌株：EM菌种由某生物制药应用技术研发中心保存，大肠杆菌CMCC44102、沙门菌ATCC9150由某生物公司实验室保存。

2 试验方法

2.1 乳酸菌的分离鉴定与活性分析

2.1.1 乳酸菌的分离纯化

从实验室-20℃冰箱中取出保藏的EM菌种，吸取适量EM菌原液加入到MRS液体培养基中，摇床培养，活化菌种。取浑浊菌液进行10倍比稀释，涂布在MRS固体培养基上，置于恒温培养箱中37℃，48 h。根据形态特征，挑取生长较为优势的菌落置于MRS液体培养基中37℃，24 h，再划线种于MRS固体培养基上37℃，48 h。重复平板划线操作3次，直至培养基上出现单菌落。

2.1.2 乳酸菌的鉴定

染色镜检：采用革兰氏染色后在显微镜下观察菌株形态。

2.1.3 产酸试验

筛选在MRS固体培养基中长势良好的5株菌接种于MRS液体培养基中，培养48h测菌液pH值，记录结果，比较其产酸能力。

2.1.4 耐酸试验

将产酸筛选出的菌株，取100μL菌液分别接种于pH值为2.0、4.0、5.0、6.0和7.0的MRS液体培养基中，37℃培养 24h，测各组菌液的OD值。

2.1.5 16S rDNA 鉴定

参照细菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取菌株DNA，使用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增。配置PCR扩增反应体系：Mix5μL、DNA模板1μL、上引物1μL、下引物1μL、ddH₂O 2 μL，总计10μL。

反应程序为：预变性95℃，5 min；变形95℃，30 s，退火55℃，30 s，延伸72℃，90 s，30个循环；终延伸72℃，10 min。

反应结束后配制1%琼脂糖凝胶，进行电泳30min，使用凝胶成像系统分析结果，产物送上海生工测序，测序结果使用BLAST 分析。

2.1.6 抑菌能力测定

在LB固体培养基中按1%接种量加入活化稀释好的大肠杆菌、沙门菌，轻摇混匀，倒入培养皿中，待凝固后打孔，每孔加入200μL培养好的乳酸菌菌液，并设置对照孔，4℃放置2h，之后37℃，12 h后观察结果。

2.2 最佳培养条件的确定

优化培养条件，包括初始pH分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，培养温度(℃)分别为30、35、37、39、40、41、42，设定培养时间为24h，检测菌液的OD值，将数据整理分析确定乳酸菌的最佳培养条件。

2.3 乳酸菌制剂的动物临床试验

2.3.1 乳酸菌制剂的准备

乳酸菌(A3菌株)微生态制剂由某生物公司制备，为固体粉末状态，活菌数为2.5×109CFU/g。

2.3.2 试验设计

试验选择体重和产蛋率相近的420日龄海兰褐蛋鸡300只，随机分成3组，每组100只，试验在某蛋鸡养殖场内进行，对照组饲喂基础日粮，试验I组、Ⅱ组分别饲喂添加0.2%、0.3%乳酸菌制剂的日粮，试验期间由专人饲养，确保采食和饮水自由，在试验期间不添加其他任何益生菌制剂与抗生素制剂，期间避免产生应激，试验期30d。试验期间每日记录各组的生产数据，结束采集各组鸡蛋和血液进行蛋品质和血液指标的检测。

2.4 统计分析

采用Excel 和SPSS22.0软件对试验数据进行整理分析，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

3 结果

3.1 乳酸菌的分离鉴定与活性结果

3.1.1 乳酸菌的分离培养

初步分离出的菌落有以下形态特征：菌落大部分为中等程度的大小并且在平皿上凸起；菌落的颜色呈现出灰白色，处于较为湿润的状态；菌落的边缘较为整齐且整体呈圆形，直径约为3.0mm。

3.1.2 镜检结果

染色镜检呈蓝紫色，单个、成双或短链排列的短杆菌，革兰染色阳性菌。

3.1.3 产酸结果

产酸能力是筛选乳酸菌的指标之一。A1-A5株菌的产酸pH值分别为6.25、5.24、3.67、4.25、3.83，其中A3、A5、A4的产酸能力较强，接下来的实验将侧重于这三株菌进行。

3.1.4 耐酸结果

如表1，在不同的酸性环境下菌液OD值可知A3、A5两株菌较为稳定，在相同的酸性环境下，这两株菌的存活率在50%以上有较强的耐酸能力，而其他菌株在30%左右。

表1 不同酸性环境下的 OD 值

综合产酸、耐酸的能力选择A3这个菌株进行深入鉴定。

3.1.5 16S rDNA鉴定结果

经DNA 提取后，将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在1500bp左右处出现目的条带。

PCR产物送样测序，进行Blast比对并同源性分析，A3分离株与NBRC100982 16S、SBT10908 16S有98%的同源性，同属于哈尔滨乳杆菌菌属。

3.1.6 抑菌能力的测定结果

A3菌株菌液对大肠杆菌、沙门菌均有良好的抑菌能力，测量菌液对大肠杆菌的抑菌圈直径为1.35cm，对沙门菌的抑菌圈直径为1.47cm，A3菌株菌液对沙门菌的抑制能力优于对大肠杆菌的抑制能力。

3.2 最佳培养条件结果

3.2.1 初始pH对A3菌株生长的影响

在初始pH在 4～5时，OD600从1.89上升到2.48，而当在5～7 时，OD600下降至1.53，由此初步确定乳酸菌的最适pH值为5.0。

3.2.2 温度对A3菌株生长的影响

在温度30～40℃时OD600值持续上升达到3.21，而40℃后 0D600值开始降低至42℃时的2.28。所以该乳酸菌的最佳培养温度为40℃。

3.3 乳酸菌制剂的动物临床试验结果

3.3.1 乳酸菌制剂对蛋鸡生产性能的影响

由表2可知，产蛋率的对照组与试验组无显著差异(P>0.05)。试验组的产蛋率比对照组有升高趋势，其中试验I组的产蛋率比对照组提高了3.33%；料蛋比与乳酸菌制剂的添加量呈正相关，试验I组、试验I组料蛋比与对照组差异显著(P<0.05)。

表2 乳酸菌制剂对生产性能的影响

3.3.2 乳酸菌制剂对蛋品质的影响

由表3可知，试验各组的蛋重、蛋黄比例相比对照组均无显著差异(P>0.05)，蛋重、蛋黄比例随着乳酸菌制剂添加的增多也随之提高。试验I组、I组蛋壳厚度显著提高了0.02mm(P<0.05)。

表3 乳酸菌制剂对蛋品质的影响

3.3.3 乳酸菌制剂对蛋鸡血清生化指标的影响

由表4可知，各项血清生化指标差异均不显著，试验I组、Ⅱ组总蛋白含量分别降低了3.9g/L和 2.33 g/L；血清中钙、磷含量与乳酸菌制剂的添加量呈正相关，试验I组、Ⅱ组钙含量分别升高了0.03mmol/L和0.04mmol/L，磷含量分别升高了0.18mmol/L和0.3 mmol/L。

表4 乳酸菌制剂对蛋鸡血清生化指标的影响

4 讨论

乳酸菌作为一种稳定机体肠道微环境、增强机体免疫力以及改善动物生产性能的益生菌，在养殖业中广泛应用。本试验分离的乳酸菌经过形态学和氨基酸序列比对鉴定为哈尔滨乳杆菌。乳酸菌在应用中之所以有良好的使用效果是因为具备良好的生物学特性。本试验发现，A3菌株具有较好的产酸和耐酸能力，可以进一步研究。乳酸菌的抑菌能力是其发挥益生效果的重要机制，本试验中乳杆菌A3对沙门菌和大肠杆菌均有抑制作用，其机制可能与该菌繁殖过程中产生某种代谢产物有关，仍需进一步研究。

微生态制剂有调节肠道菌群、增强免疫力、显著提高家禽生产性能等优势，因此，作为新型饲料添加剂在市场上热销。本试验结果显示，添加不同比例乳酸菌制剂能显著降低料蛋比，与于明等研究结果一致。产蛋率指标试验组与对照组无显著差异，可能与添加时间较短有一定关系。0.3%组的产蛋率低于0.2%组，可能由于菌群量大而产生抑制作用，因此在应用中要适量添加。

有研究结果显示，添加不同比例的微生态制剂可提高蛋白转化率、提高哈夫单位以及改善蛋壳厚度与蛋形指数，与本试验中蛋壳厚度的增加结果相似。林英庭等研究表明益生菌可促进饲粮中钙、磷、粗蛋白及矿物质的消化与吸收使蛋重、蛋黄比例增加，这与本试验结果一致。

血清总蛋白与蛋白质代谢水平有关，本试验结果表明，日粮中添加微生态制剂可能会使血清中的蛋白质更好的转化到鸡蛋中去，从而使总蛋白数值降低，与其他人员研究结果一致网。血清中的钙、磷水平与蛋壳质量和钙磷吸收呈正相关，本试验表明乳酸菌制剂能提高血清中钙磷的水平，提示该制剂能改善蛋壳质量。

5 结论

哈尔滨乳杆菌A3具有较强的产酸能力及耐酸能力，该菌株过氧化氢试验阴性。在40℃条件下，培养基初始pH为5是该菌株最佳培养条件，用该菌株制备的微生态制剂以0.2%的添加量最合适且可以改善蛋鸡的生产性能、蛋品质及血清生化指标。

参考文献：略。

作者：刘少杰，张全朝等发表于《今日畜牧兽医》2024年第4期。