丁酸梭菌对肉鸡生产性能、免疫力、小肠黏膜形态和盲肠菌群的影响

 

摘要：试验旨在探讨日粮中添加丁酸梭菌(Clostridium butyricum，CB)对肉鸡生产性能、免疫力、小肠黏膜形态和盲肠菌群的影响。采用单因素试验设计，选择1日龄健康AA肉鸡720只，随机分为6组，每组120只，设6个重复，每个重复20只，试验期42d，对照组饲喂基础日粮，试验I、I、Ⅲ、IV和V组分别在基础日粮基础上添加CB250、500、750、1000mg.kg-1和1 250 mg.kg-1。结果显示：与对照组相比，试验IV组(1000 mg.kg-1)对提高生产性能效果最好，平均日采食量(AFDI)高于对照组(P>0.05)，平均日增重(ADG)提高了6.41%(P<0.05)，料重比(F/G)降低了4.29%(P<0.05)；试验IV组对增强免疫力效果最好，42日龄时，胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数分别提高了6.45%(P<0.05)、12.92%(P<0.05)和13.94%(P<0.05)，IgA、IgG和IgM含量分别提高了27.36%(P<0.05)、28.95%(P<0.05)和28.24%(P<0.05)。试验IV组对改善小肠黏膜形态效果最好，42日龄时，绒毛高度(VH)提高了13.95%(P<0.05)，隐窝深度(CD)降低了12.03%(P<0.05)，VH/CD值提高了29.56%(P<0.05)；试验IV组对改善肉鸡盲肠菌群结构效果最好，42日龄时，大肠杆菌数量降低了18.19%(P<0.05)，沙门氏菌数量降低了16.07%(P<0.05)，乳酸杆菌数量提高了13.96%(P<0.05)，双歧杆菌数量提高了19.57%(P<0.05)。说明肉鸡日粮中添加CB可以提高生产性能，增强免疫力，改善小肠黏膜形态，调节盲肠菌群，最适宜添加剂量为1000 mg.kg-1。

关键词：丁酸梭菌；肉鸡；生产性能；免疫力；小肠黏膜形态；盲肠菌群

目前，我国已成为世界上第2大肉鸡生产和消费大国，鸡肉及其制品质量安全水平得到了大幅提升。尽管抗生素和化学合成抗菌药物作为饲料添加剂应用于肉鸡生产，在提高生产性能、预防疾病发生、改善肉品品质等方面发挥了积极作用，但由于长期大量使用、过度使用甚至滥用，也产生了一系列负面效应，包括破坏肠道菌群平衡、增强细菌耐药性、降低机体抗病力、由于药物残留诱发食品安全事件、危害人类健康、造成环境污染等。迄今，我国和世界上大多数国家已制定相关政策，限制和禁止在肉鸡饲料中使用抗生素和化学合成抗菌药物中。因此，研发既能增产增效又具无毒、无害、低残留等特点的新型饲料添加剂，是目前动物营养领域普遍关注的研究课题。

益生菌用作肉鸡饲料添加剂，不仅具有促进动物生长、改善免疫调控、维持肠道正常菌群、调节动物消化代谢、减少环境污染等作用，而且具有不产生耐药性、无残留、绿色环保等优点，是肉鸡生产中替代抗生素的新一代绿色饲料添加剂。目前，用作肉鸡饲料添加剂的益生菌主要有芽孢杆菌类(如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)、乳酸菌类(如双歧杆菌和嗜酸乳杆菌)、酵母菌类(如酿酒酵母和石油酵母)和霉菌类(如米曲霉和黑曲霉)。XuY.L.等研究报道了枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能、免疫力、短链脂肪酸产量、抗氧化能力和盲肠菌群的影响；A.E.E.A.El-Moneim等研究报道了两歧双歧杆菌和长双歧杆菌对肉仔鸡生产性能、回肠组织形态、血液学指标和生化指标的影响；LinJ.等研究报道了酿酒酵母水解物对肉仔鸡生长性能、免疫功能和肠道健康的影响。有关研究结果表明，益生菌作为新型微生态制剂，已在肉鸡生产中发挥了积极作用，并展示出了广阔的发展前景。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum，CB)由日本学者千叶医科大学宫入近治博士于1933年首先发现并报道。CB具有促进动物生长、调节肠道菌群平衡、增强机体免疫力和提供营养等作用，已成为新型微生态饲料添加剂。2009年，中国农业部批准了CB及其制剂在饲料中作为添加剂使用，但其应用研究尚处于起步阶段，尤其是在肉鸡生产中的应用效果报道不一，肉鸡日粮中适宜添加剂量尚存在较大争议。本研究在综合比较前人研究基础上，采用单因素试验设计，通过CB对肉鸡生产性能、免疫力、小肠黏膜形态和盲肠菌群的影响研究，以期为肉鸡生产中合理利用CB提供试验依据。

1 试验材料

1.1 药品及试剂

CB，活菌含量为1×109cfu·g-1，某生物公司提供；鸡血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒，武汉纯度生物科技有限公司(武汉)；其他试剂市售所得，均为分析纯。

1.2 试验动物

选择1日龄AA肉仔鸡720只，雌雄混养，初始平均体重为(50.48±1.51)g·只-1，河南省鹤壁市博龙种禽有限公司生产。

2 方法

2.1 试验设计与日粮组成

采用单因素试验设计，将720只AA肉仔鸡随机分为1个对照组与5个试验组，每组120只，设6个重复，每个重复20只，试验期42d。对照组饲喂基础日粮，试验I、I、Ⅲ、IV和V组分别在基础日粮基础上添加CB250、500、750、1000mg·kg-1和1250mg·kg-1。试验动物饲喂相同的基础日粮，该日粮可满足或略超过NRC(1994)肉鸡营养需求的建议。基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 试验基础日粮组成与营养水平(干物质基础)

注：1%预混料添加剂为每千克基础日粮中提供Mn 80mg，Zn 60mg,Fe 80mg, Cu 8mg, I 0.35mg,Se 0.15mg，维生素A 3000IU，维生素D 1250IU，维生素E 15IU，维生素K 2.2mg，维生素B1 1.6mg，维生素B2 2.8mg，维生素B6 3.1mg，维生素B12 0.01mg，泛酸10.5mg，烟酸40mg，叶酸0.72mg，生物素0.12mg，胆碱1100mg；代谢能为理论计算值，其余营养成分为测定值。

2.2 饲养管理

试验鸡饲养管理参照《AA肉鸡饲养管理手册》进行。各组鸡在同一栋鸡舍中饲养。7日龄新城疫( newcastle disease，ND)Lasota株IV系弱毒苗滴鼻点眼首免，14日龄法氏囊(infectious bursal disease ,IBD)弱毒苗饮水免疫，21日龄ND Lasota株V系弱毒苗加强免疫。鸡舍温度第1周为32～35℃，第2周为30～32℃，以后每周下降2～3℃，过渡到自然环境温度。采用每天24h人工光照。

2.3 样品收集与指标测定

2.3.1 生产性能测定

每周周一清晨对各处理组肉鸡空腹称重，记录体重(body weight，BW)、体增重(body weight gain，BWG)和采食量(feed intake，FI)，计算平均日采食量(average daily feed intake，AFDI)、平均日增重(average daily gain，ADG)和料重比(feed togain ratio，F/G)。计算公式如下。

平均采日食量(ADFI)=采食量/肉鸡只数/试验天数

平均日增重(ADG)=体增重/试验天数

料重比(F/G)=饲料消耗量/体增重

2.3.2 免疫指标测定

在肉鸡42日龄时，从各处理组每个重复中随机抽取1只肉鸡，共计36只，颈静脉放血致死，摘取胸腺、脾脏和法氏囊，计算免疫器官指数。同时，对随机抽取的36只肉鸡，翼下静脉采血，4℃ 5000 r/min离心5min得到血清，用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清中IgA、IgG和IgM的含量，操作步骤参照试剂盒说明书进行。

免疫器指数(g·kg-1)=免疫器官重(g)/宰前活重(kg)

2.3.3 小肠黏膜形态观察

参照L.A.Rubio等所述的方法，对随机抽取的36只肉鸡屠宰，宰后截取十二指肠部位3cm肠段，用0.9%生理盐水冲洗，用10%福尔马林溶液固定24h，放入70%的乙醇溶液中保存备用。肠管组织部分用乙醇逐级脱水，石蜡包埋后切片，苏木素-伊红(hematoxylin and eosin staining,H.E.)染色，树胶封片，显微镜40倍视野下观察并拍照，测量其绒毛高度(villum heigh，VH)以及与之相连的隐窝深度(crypt depth，CD)，计算绒隐比(VH/CD)值。

2.3.4 盲肠菌群测定

将上述随机抽取并屠宰的36只肉鸡，采集盲肠肠段中的盲肠内容物放入无菌样品袋中，4℃保存，24h内进行分析。将盲肠内容物用无菌生理盐水稀释10倍，即为10稀释液，依次稀释至10,然后将0.1mL稀释后的样本接种到选择性琼脂中进行细菌计数。大肠杆菌用MacConkey琼脂孵育，在37.5℃孵育24h，沙门氏菌用H.E.琼脂在37.5℃孵育24h，双歧杆菌和乳杆菌用TPY琼脂在37.5℃厌氧培养箱中孵育48h。采用平板菌落计数法进行计算，测定盲肠内容物中大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的数量。

2.4 数据统计分析

试验数据采用SPSS16.0统计软件中one-wayANOVA程序进行单因素方差分析，结果用“平均值±标准差”表示，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

3 结果与分析

3.1 肉仔鸡基础日粮中添加CB对生产性能的影响

肉仔鸡生产性能测定结果见表2。CB对ADFI的影响，各试验组42d试验期的ADFI比对照组有一定提高，但无显著影响(P>0.05)。CB对ADG的影响，各试验组肉鸡的ADG均高于对照组，其中试验IV组效果最好，比对照组提高了6.41%(P<0.05)，经统计分析，试验Ⅲ、IV和V组与对照组之间差异显著(P<0.05)，三组之间差异不显著(P>0.05)。CB对F/G的影响，与对照组相比，试验IV组的F/G为1.785，较对照组1.865降低了4.29%(P<0.05)。由此表明，饲粮中添加CB能够提高肉鸡生产性能，适宜添加量为1000mg.kg-1。

表2 丁酸梭菌对肉鸡生产性能的影响

注：同列数据肩标不含相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，含相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，（下表同）。

3.2 肉仔鸡基础日粮中添加CB对免疫力的影响

3.2.1 免疫器官指数

免疫器官指数计算结果见表3。在肉鸡42日龄时，肉鸡胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数试验组与对照组相比均有提高，其中试验IV组提高幅度最大，分别提高了6.45%、12.92%和13.94%，试验Ⅲ、IV、V组与对照组相比差异显著(P<0.05)。由此表明，饲粮中添加CB能够提高肉鸡免疫器官指数。

表3 丁酸梭菌对肉鸡免疫器官指数的影响

3.2.2 血清中IgA、IgG和IgM含量

免疫球蛋白含量测定结果见表4。肉鸡42日龄时，各试验组IgA、IgG和IgM含量均高于对照组，除试验I组与对照组差异不显著(P>0.05)外，试验Ⅱ、Ⅲ、IV组和V组均差异显著(P<0.05)，其中试验IV组含量最高，分别比对照组提高了27.36%、28.95%和28.24%。结果说明，在肉鸡日粮中添加1000mg.kg-1的CB具有提高肉鸡血清免疫球蛋白含量的作用。

3.3 小肠黏膜形态

小肠黏膜形态指标测定结果见表5。CB对VH的影响，试验组与对照组相比，各试验组均高于对照组，差异显著(P<0.05)，其中试验IV、V组提高幅度较大，分别提高了13.95%(P<0.05)和16.38%(P<0.05)，两组间差异不显著(P>0.05)。CB对CD的影响，试验组与对照组相比，各试验组肉鸡隐窝深度均低于对照组，除试验I、I组差异不显著外(P>0.05)，试验Ⅲ、IV、V组均差异显著(P<0.05)，比对照组分别降低了9.93%、12.03%、12.55%，三组间差异不显著(P>0.05)。CB对VH/CD的影响，各试验组VH/CD比对照组均有提高，除试验I组差异不显著外(P>0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ、IV、V组均差异显著(P<0.05)，但四组间差异不显著(P>0.05)，其中试验IV、V组效果明显，比对照组分别提高了29.56%、33.09%。由此表明，饲粮中添加CB能够提高VH/CD值，提高肉鸡消化能力，添加剂量以1000mg.kg-1为宜。

表5 丁酸梭菌对肉鸡小肠黏膜形态的影响

3.4 盲肠菌群数量

盲肠内容物菌群测定结果见表6。在肉鸡42日龄时，各试验组与对照组相比，大肠杆菌数量明显低，除试验I组差异不显著(P>0.05)外，试验Ⅱ、Ⅲ、IV、V组均差异显著(P<0.05)，分别降低了7.44%、15.22%、18.19%、18.54%。沙门氏菌数量明显降低，除试验I组差异不显著(P>0.05)外，试验Ⅱ、Ⅲ、IV、V组均差异显著(P<0.05)，分别降低了8.42%、12.48%、16.07%、16.54%；乳酸杆菌数量明显增多，除试验I组差异不显著(P>0.05)外，试验Ⅱ、Ⅲ、IV、V组均差异显著(P<0.05)，分别提高了6.74%、12.64%、13.96%、14.20%。双歧杆菌数量明显增多，除试验I组差异不显著(P>0.05)外，试验Ⅱ、Ⅲ、IV、V组均差异显著(P<0.05)，分别提高了8.42%、15.51%、19.57%、19.70%。其中以试验IV和V组效果较好，但两者之间差异不显著(P>0.05)。由此表明，饲粮中添加CB能够减少有害菌数量，提高有益菌数量，改善盲肠菌群，提高肉鸡消化能力和抗病力，添加剂量以1000mg.kg-1为宜。

表6 丁酸梭菌对肉鸡盲肠菌群的影响

4 讨论

4.1 CB对肉鸡生产性能的影响

CB是近年来发现的较为理想的益生菌，能够提高动物生产性能。WangK.L.等和Ghen L.等研究表明，CB的作用机制有三个方面：一是CB在肠道内的主要产物为丁酸，是肠道细胞的第一能量来源，对于肠黏膜细胞的增殖与修复具有十分重要的作用；二是丁酸可以作为酸源，调节肠道pH，从而促进有益菌生长、抑制有害菌繁殖，维持动物肠道微生态平衡；三是CB在动物体内增殖过程中可产生大量内源消化酶，有助于充分提高饲料消化利用率。李文嘉等研究报道，在爱拔益加肉鸡日粮中添加1×109cfu·kg-1的CB，42日龄时，与对照组相比，ADG提高了8.43%，空肠VH/CD提高了54.20%，回肠VH/CD提高了60.76%，结果表明，CB能提高肉鸡的生长性能和饲料利用率，改善肉鸡肠道形态，提升肠道免疫和屏障功能。本研究结果表明，各试验组ADG均比对照组高，其中1000mg.kg-1组效果最好。

4.2 CB对肉鸡免疫力的影响

4.2.1 CB对肉鸡免疫器官指数的影响

肉鸡的主要免疫器官包括胸腺、脾脏和法氏囊，免疫器官指数反映出免疫能力的强弱。何菊等研究报道，CB能够促进肉鸡免疫器官的生长发育，且存在一定的量效关系。YangT.T.等研究表明，在罗斯308肉鸡日粮中添加2×108cfu·kg-1的CB，在21日龄和39日龄测定免疫器官指数，其中胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数都得到显著提高。蒋玲艳等研究报道，选择麻黄鸡为试验动物，日粮中添加CB，设置低剂量组(2×105cfu·g-1)、高剂量组(5×105cfu·g-1)和对照组，结果表明，42日龄时高剂量组肉鸡ADG、FGR和免疫器官指数均显著高于对照组，高剂量组与低剂量组之间差异不显著。刘亭婷等研究表明，1000mg.kg-1添加组的蛋用仔公鸡脾脏指数显著高于对照组，肉鸡日粮中最适宜的添加水平为1000mg.kg-1，与本研究结果相一致。

4.2.2 CB对肉鸡血清IgA、IgG和IgM含量的影响

免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是机体受到外界抗原或病原菌刺激后，由机体B淋巴细胞产生的一种可以结合抗原或病原菌的小分子蛋白质，Ig是人体体液免疫的重要组成部分，是机体抗感染的重要物质，主要存在于血清中。刘砚涵等研究报道，在北京鸭日粮中添加CB，设置低剂量组(100 mg·kg-1)、中剂量组(200mg·kg-1)和高剂量组(400 mg ·kg-1)3个组，结果表明，与对照组相比，中、高剂量组可显著提高北京鸭血清中IgA和IgG的含量。LiaoX.D.等研究报道，在AA肉鸡日粮中添加CB，添加水平分别为2.5×108、5×108cfu·kg-1和1×109cfu·kg-1，肉鸡42日龄时，试验组与对照组相比，3个试验组肉鸡血清中IgA、IgG和IgM含量均显著高于对照组(P<0.05)，其中以添加水平1×109cfu·kg-1组含量最高。本研究也取得了较为一致的结果，表明肉鸡日粮中添加CB能够提高血清中Ig含量，从而提高机体的免疫力。

4.3 CB对肉鸡小肠黏膜形态的影响

关于CB对肉鸡小肠黏膜形态影响的报道较为少见，但在其他动物养殖研究中已有相关报道。庞敏等研究报道，饲粮添加CB 500mg·kg-1能显著降低断奶仔猪的回肠CD，提高VH/CD值，认为CB主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质，对肠道上皮组织的再生和修复起重要作用。郑有秀等研究报道，断奶仔猪日粮中添加CB500、1000和2000mg·kg-1，经过30d试验，结果表明，与对照组相比，空肠VH分别提高了35.71%、33.59%和47.36%，VH/CD值分别提高了48.03%、19.69%和22.83%，CB可改善断奶仔猪肠道结构，增强机体消化能力。由此表明，饲粮中添加CB能够提高VH/CD值，提高肉鸡消化能力，与本研究结果相一致。

4.4 CB对肉鸡盲肠菌群的影响

CB是调节动物肠道微生态平衡的有益菌，能够通过竞争、排斥、替代以及改变肠道微环境来有效调节肠道微生态的菌群平衡，促进肠道内双歧杆菌、乳酸菌和拟杆菌等有益菌的增殖和发育，同时抑制肠道内致病性大肠杆菌、葡萄球菌、念珠菌、克雷伯菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌和魏氏梭菌等有害菌的生长繁殖，从而起到纠正肠道菌群失调、改善肠道内微生态环境的作用网。其作用机理是肠道中大多益生菌生活的最适pH是偏酸性，而大部分致病菌为弱酸性偏碱性，CB可微调肠道环境的pH，从而促进益生菌的生长，抑制有害菌的生长，益生菌数量的增加会进一步压缩有害菌的生存空间，加剧了有害菌的脱落和死亡，起到改善菌群群落的作用。关于CB对肉鸡肠道菌群影响的报道较为少见，而在生猪饲养中的研究和应用较多。郑有秀等研究报道，在断奶仔猪日粮中添加1000mg·kg-1CB,盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌数量达到最高水平；试验组盲肠中的大肠埃希菌较对照组分别降低了23.18%和23.49%；盲肠沙门菌较对照组分别降低了16.56%和14.17%，认为断奶仔猪日粮中添加1000mg.kg-1CB效果较好。

5 结论

本研究结果表明，肉鸡日粮中添加CB可以提高生产性能，增强免疫力，改善小肠黏膜形态，调节盲肠菌群，提高消化功能，最适宜添加剂量为1000 mg·kg-1。

参考文献：略

作者：张作栋，王丽莎，张海棠发表于《饲料博览》2023年第3期