灭活植物乳杆菌及其代谢物对克氏原螯虾生长性能和肠道健康的影响

 

摘要：试验旨在研究灭活植物乳杆菌及其代谢物(LPM)对克氏原螯虾生长性能和肠道健康的影响。试验选择初重为(8.16±0.23)g的克氏原螯虾162尾随机分为3组，每组3个重复，每个重复18尾虾。配制3组分别含0(对照组)、300(LPM-300组)和600mg/kg(LPM-600组)的LPM的配合饲料，配制两个试验组饲料时，在对照组饲料配方基础上用3%面粉代替3%的花生粕，使饲料蛋白质水平降低1.5%。试验期42d。结果显示：饲料中添加600mg/kgLPM，克氏原螯虾的增重率、特定生长率、蛋白质效率和蛋白质沉积率显著高于对照组(P<0.05)，饲料系数显著低于对照组(P<0.05)。饲料中添加600mg/kgLPM，全虾粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量显著高于对照组(P<0.05)。饲料中添加300、600mg/kgLPM，肌肉粗脂肪含量显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比，饲料中添加LPM可显著提高克氏原螯虾血清总蛋白(TP)含量(P<0.05)，降低谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性(P<0.05)；饲料中添加600mg/kgLPM可显著提高克氏原螯虾血清白蛋白(ALB)含量和碱性磷酸酶(AKP)活性(P<0.05)。添加600mg/kg LPM可显著提高肝胰脏和肠道蛋白酶活性(P<0.05)。添加600mg/kgLPM可显著降低克氏原螯虾绒毛宽度(P<0.05)。对照组和试验组的肝胰脏细胞结构完整，无损伤或病变，LPM-300组的B细胞、F细胞和R细胞数量明显多于对照组。研究表明，饲料中添加600mg/kgLPM有利于改善克氏原螯虾肠道组织结构，提高非特异性免疫能力，促进了饲料蛋白质的利用。

 

关键词：克氏原螯虾；灭活植物乳杆菌及其代谢物；生长性能；肠道健康

 

克氏原螯虾(Procambarus clarkia)又名小龙虾，其肉味鲜美，营养价值高，生长快，对环境适应力强，养殖效益高，近年来备受青睐。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，LP)是革兰氏阳性菌，属于乳酸菌的同型多功能发酵菌，可在动物肠道内定植。植物乳杆菌在肉鸡、兔、猪等陆生动物养殖中已有广泛应用，具有促生长、抗菌、提高免疫力和改善肠道健康等益生功能。在水产动物养殖中，植物乳杆菌被证实对许氏平鲉(Sebastes schlegelii)、仿刺参(Apostichopus japonicus)和黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii)等具有提高消化酶活力、改善肠道健康、抑菌、提高机体免疫力和促生长作用。由于水产饲料在加工过程中需经过较长时间的高温环境，且使用活菌运输存储不方便，增加了传染疾病的风险，活菌在水产饲料中的使用受到限制。近年来，将益生菌加工处理的后生元产品备受关注，如灭活植物乳杆菌及其代谢物(LPM)可耐高温，其主要活性成分为细菌素、短链脂肪酸等。在草鱼(Ctenopharyngodon idella)饲料中添加300～600 mg/kg灭活植物乳杆菌及其代谢物(灭活菌数1.2×106个/g)可显著提高草鱼肝胰脏和肠道蛋白酶活性，改善肠道形态结构，从而促进草鱼生长。目前关于LPM在克氏原螯虾养殖中的应用研究尚未见报道。本试验探讨LPM对克氏原螯虾肠道健康、非特异性免疫力和生长性能的影响，为LPM在水产动物健康养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验配制3种饲料，以面粉、豆粕、菜粕、花生粕和棉籽蛋白为主要原料，以鱼油和豆油为主要脂肪源，基础饲料组成及营养水平见表1。各组LPM分别为0(对照组)、300(LPM-300组)和600mg/kg(LPM-600组)，以膨润土配平。饲料中灭活植物乳杆菌含量分别为0、3.60×106、7.20×106个/g。对照组饲料蛋白质水平为35.6%，脂肪水平为7.1%。两试验组饲料配制时，在对照组饲料配方基础上用3%的面粉代替3%的花生粕，使饲料蛋白质水平降低1.5%。各主要原料粉碎后过0.3 mm的筛网，充分混合，用绞肉机加工成直径2.0mm的条状，置于60℃烘箱中烘3h，破碎，于-20℃保存。LPM由北京某生物技术有限公司提供，主要成分包括细菌素、短碳链的有机酸和脂肪酸等物质，灭活菌数为1.20×1010个/g，乳酸含量≥6.5%，蛋白含量≥2%。

表1基础饲料组成及营养水平(干物质基础)单位：%

注：维生素预混料和矿物盐预混料配方参照杨文秀的试验配制。

试验用虾由湖北潜江市某商业孵化场提供。选择初重为(8.16±0.23)g的克氏原螯虾162尾，体质健康、附肢完全、大小基本一致，随机分为3组，每组3个重复，每个重复18尾虾。

1.2 饲养管理

克氏原螯虾饲养于中国水产科学研究院长江水产研究所室内养殖系统，养殖箱(1.00m²，水深0.35m，水体积为350L)。以对照组饲料驯化2周，待正常摄食后饥饿1d，开始养殖试验。每日按虾体重的3%～5%分2次投喂(8：30、17：00)，早、晚饲料质量投喂比例为3：7，2h后用虹吸管收集剩余饲料，烘干称重。每天根据前1d克氏原螯虾的摄入量对投喂量进行调整。及时捞出死虾，并称重记录。

养殖期间每日上午换水1/3，水温25～28℃，pH值8.3±0.1，溶氧浓度>5mg/L，氨氮浓度<0.05 mg/L。试验期6周。

1.3 样品采集

饲养试验开始时，记录虾体初始质量，另取9尾虾以测定全虾初始蛋白质含量。饲养试验结束后饥饿24h，称量虾体质量，计算增重率、成活率、饲料系数和特定生长率等生长性能指标。

每箱捞4尾克氏原螯虾测定全虾基本营养成分。每箱捞虾6尾于围心窦处抽取血淋巴，静置4h，4℃、14400 r/min离心20min，取上层血清，用于测定血清生化指标。取肌肉，称量质量，用于测定基本营养成分含量。

取肝胰脏和肠道，称取肝胰脏质量，分别取肝胰脏(lcm×1cm)和中肠(1cm)用多聚甲醛固定液固定，用以制作组织切片，其余肝胰脏和肠道用于测定蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶消化酶活性。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能

根据克氏原螯虾初重、末重、肝胰脏质量、肌肉质量、投饲量、饲料蛋白质含量、初始全虾粗蛋白质含量、终末全虾蛋白质含量和存活尾数，计算克氏原螯虾生长性能指标。

1.4.2 营养成分

全虾、肌肉及饲料中水分、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪含量分别采用103℃烘干法(GB5009.3-2016)、550℃高温灼烧法(GB5009.4-2016)、凯氏定氮法(GB5009.5-2016)和索氏抽提法(GB5009.6-2016)测定。

1.4.3 血清生化指标

采用Sysmex生化分析仪(BX-3010)测定血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)和葡萄糖(GLU)的含量及碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性。

1.4.4 肝胰脏和肠道消化酶活性

使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒及操作方法检测肝胰脏和肠道脂肪酶活性(甲基试卤灵底物法)、蛋白酶活性(福林酚试剂法)和淀粉酶活性(碘显色法)。

1.4.5 肝胰脏和肠道组织切片

采用苏木精-伊红(H.E.)染色法制作肝胰脏和肠道组织切片，显微镜观察、拍照，进行图像结果分析。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析，Tukey's均值法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加LPM对克氏原螯虾生长性能的影响(见表2)

由表2可知，当饲料中LPM添加量为300mg/kg时，增重率、蛋白质效率、蛋白质沉积率均与对照组无显著差异(P>0.05)，且饲料系数低于对照组(P>0.05)，说明在饲料中添加300mg/kgLPM可实现用3%面粉替代3%花生粕，降低饲料蛋白1.5%。当饲料中LPM添加量为600 mg/kg时，克氏原螯虾的增重率、特定生长率、蛋白质效率和蛋白质沉积率分别较对照组显著提高了18.25%、13.43%、30.89%和14.75%(P<0.05)。饲料系数在LPM添加量为600mg/kg时达到最低值，较对照组显著降低了10.71%(P<0.05)。各组成活率、摄食率、含肉率和肝体比差异均不显著(P>0.05)。

表2饲料中添加LPM对克氏原螫虾生长性能的影响

注：同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)；表3与此同。

2.2 饲料中添加LPM对克氏原螯虾全虾和肌肉基本成分的影响(见表3)

由表3可知，饲料中添加600mg/kg LPM时，全虾粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均最高，分别比对照组提高了10.78%、22.03%和17.96%(P<0.05)。

LPM添加量为300mg/kg和600mg/kg时，肌肉粗脂肪含量分别比对照组提高了19.05%和33.33%(P<0.05)。各处理组全虾和肌肉中水分含量、肌肉中粗蛋白和粗灰分含量差异均不显著(P>0.05)。

表3饲料中添加LPM对克氏原螯虾全虾和肌肉基本成分的影响(湿重) 单位：%

2.3 饲料中添加LPM对克氏原螯虾血清生化指标的影响(见表4)

由表4可知，与对照组相比，饲料中添加LPM可显著提高克氏原螯虾血清TP含量(P<0.05)，降低AST和ALT活性(P<0.05)。克氏原螯虾血清ALB含量和AKP活性随着LPM添加量的增加有升高的趋势，饲料中添加600 mg/kg LPM时，血清ALB含量和AKP活性比对照组提高了13.89%、54.50%(P<0.05)。各组克氏原螯虾血清TG和GLU含量差异均不显著(P>0.05)。

表4饲料中添加LPM对克氏原螯虾血清生化指标的影响

注：同列数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)；表5、表6与此同。

2.4 饲料中添加LPM对克氏原螯虾肝胰脏和肠道消化酶活性的影响(见表5)

由表5可知，与对照组相比，饲料中添加600mg/kgLPM可使克氏原螯虾肠道淀粉酶活性显著升高(P<0.05)，肝胰脏淀粉酶活性显著降低(P<0.05)。克氏原螯虾肝胰脏和肠道蛋白酶活性随着饲料中LPM添加量的增加有升高的趋势，其中LPM-600组肝胰脏和肠道蛋白酶活性分别比对照组提高了43.08%、27.58%(P<0.05)。LPM添加组肝胰脏和肠道脂肪酶活性均显著低于对照组(P<0.05)。

表5LPM对克氏原螯虾肝胰脏和肠道消化酶活性的影响

2.5 饲料中添加LPM对克氏原螯虾肝胰脏和肠道组织形态的影响(见表6、图1、图2)

由表6、图1可知，克氏原螯虾肠道绒毛数量随着饲料中LPM添加量的增加呈升高的趋势，但LPM添加组与对照组相比差异不显著(P>0.05)。LPM-600组克氏原螯虾绒毛宽度显著低于对照组(P<0.05)，而肠道绒毛长度和肠壁肌肉层厚度略高于对照组(P>0.05)。

由图2可知，对照组和试验组的肝胰脏细胞结构完整，无损伤或病变。LPM-300组的B细胞、F细胞和R细胞数量明显多于对照组。

表6饲料中添加LPM对克氏原螯虾肠道黏膜结构的影响

3 讨论

3.1 LPM对克氏原螯虾生长性能和肠道健康的影响

植物乳杆菌作为乳酸菌的同型多功能发酵菌，可在动物肠道内定植，含有丰富的维生素和氨基酸等，可改善肠道健康，促进营养物质消化吸收，提高动物生产性能。关于植物乳杆菌促进动物生产性能的报道在畜禽类方面较多，而在水产动物方面报道较少。在饲料中添加1.0×106CFU/g的植物乳杆菌可使花鲈(Lateolabrax maculatus)的增重率显著提高34.16%，特定生长率提高26.74%，肥满度提高9.77%，饲料系数降低16.30%。在饲料中添加1.0×106CFU/g植物乳杆菌饲喂细鳞鲑(Brachymystax lenok)28d和56d，增重率分别提高34.97%和9.27%，特定生长率分别提高31.88%和11.30%。在饲料中添加1.0×107CFU/g植物乳杆菌饲喂尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)，增重率显著提高13.58%，特定生长率显著提高8.37%。本试验中，在饲料中添加600mg/kg LPM，高克氏原螯虾的增重率提高18.25%，特定生长率提高13.43%，饲料系数降低10.71%，表明添加LPM提高了克氏原螯虾的生长性能，与上述报道一致。

小肠是营养物质消化吸收的主要部位，其与营养物质接触的表面积越大，吸收营养物质越多。营养物质的吸收增多是LPM促进克氏原螯虾生长的直接原因。肠道组织结构中肠绒毛数量、长度和肌肉层厚度可反映肠道的健康状态，肠绒毛数量越多、长度越长、肠道肌层越厚，对营养物质吸收能力越强。本试验中，饲料中添加600mg/kgLPM可使克氏原螯虾的绒毛数量、绒毛长度和肌肉层厚度分别较对照组提高了10.58%、0.67%和1.31%，与肠道组织结构切片观察结果一致，与草鱼、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和大口黑鲈(Micropterus salmoides)的研究结果一致。添加LPM可使克氏原螯虾肠道组织结构发生变化，可能与LPM在克氏原螯虾肠道中释放出有益菌成分影响了肠道黏膜细胞结构有关，具体影响机制需要进一步研究。

3.2 LPM对克氏原螯虾全虾和肌肉基本成分及蛋白质沉积的影响

有研究表明，植物乳杆菌能够改善水产养殖动物的肌肉品质。水产动物机体和肌肉水分、蛋白质、粗脂肪和粗灰分等基本成分含量是影响其肌肉品质的重要指标。有研究表明，在花鲈饲料中添加1.0×106～1.0×1010 CFU/mL植物乳杆菌可显著提高肌肉中粗灰分含量，降低粗脂肪含量，而对粗蛋白和水分含量无显著影响。与对照组相比，在饲料中添加1.0×107CFU/g植物乳杆菌可使石银鲑幼鱼(Oncorhynchus kisutch)肌肉中粗蛋白含量显著提高1.05%。添加1.0×108 CFU/g植物乳杆菌饲喂日本鳗鲡(Anguillajaponic)28d后，肌肉中蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量与对照组相比差异不显著。在凡纳滨对虾幼虾饲料中添加植物乳杆菌可显著提高肌肉粗脂肪含量，对粗蛋白质和水分含量无显著影响。本试验中，在饲料中添加600mg/kg的LPM可使克氏原螯虾全虾粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量提高10.78%、22.03%和17.96%，肌肉粗脂肪含量提高33.33%，各组肌肉中粗蛋白和粗灰分含量、全虾和肌肉中水分含量差异均不显著。由此可见，饲料中添加600mg/kg LPM对克氏原螯虾全虾和肌肉营养成分具有调节作用，但对全虾和肌肉中不同基本成分的影响与上述研究结果不完全一致，可能与植物乳杆菌添加剂的形式、饲喂动物的种类、喂养方式等因素有关。

本研究中，与对照组相比，饲料中添加600mg/kgLPM可使全虾粗蛋白含量、蛋白质效率和蛋白质沉积率显著提高，饲料系数显著下降，说明饲料中LPM添加量为600mg/kg时可提高克氏原螯虾对饲料蛋白质的利用，增加机体蛋白质的沉积，与促生长结果一致。田娟等在草鱼饲料中添加300mg/kgLPM，全鱼粗蛋白含量、蛋白质效率和蛋白质沉积率均较对照组显著提高了4.40%、11.97%和7.64%；在草鱼饲料中添加600mg/kgLPM，肌肉粗蛋白质含量达到最高，为183.97g/kg，与本研究结果类似。本试验中，降低基础饲料1.5%的饲料蛋白，添加300mg/kg LPM不会影响克氏原螯虾的生长性能，添加600 mg/kg LPM可显著提高克氏原螯虾的生长性能和饲料利用率。综上所述，在克氏原螯虾饲料中添加300～600 mg/kg LPM可节约饲料蛋白，这可能与LPM促进了克氏原螯虾机体蛋白质沉积有关。

3.3 LPM对克氏原螫虾血清生化指标的影响

血清生化指标可反映动物机体健康情况、营养情况及代谢能力等。克氏原螯虾属于无脊椎动物，主要通过非特异免疫系统来调节其免疫功能。TP、ALB和AKP等是反映克氏原螯虾非特异性免疫功能的重要指标，TP包括ALP和球蛋白(GLB)，TP和ALB含量与机体免疫、蛋白质沉积有关，其含量越高免疫功能越强、蛋白质沉积越多，动物机体生长越快。AKP又称正磷酸单酯磷酸水解酶，是重要代谢调控酶，在动物机体免疫中发挥重要作用，常用于评估水生动物的非特异性免疫能力。在草鱼饲料中添加600mg/kgLPM时，血清TP、ALB含量和ALP活性分别较对照组显著提高4.40%、11.97%和7.64%。在大口黑鲈饲料中添加1.0×108CFU/g植物乳杆菌LP-37，其AKP活性较空白对照组显著提高了92.85%。本试验中，饲料中LPM添加量为600mg/kg时，克氏原螯虾血清TP、ALB含量和AKP活性较对照组显著提高了9.36%、13.89%、54.50%，这说明LPM具有促进机体蛋白质合成，提高非特异性免疫功能的作用，与上述研究结果一致。

血清GLU和TG是反映机体糖脂代谢的重要指标。GLU是动物机体的主要组成成分，也是机体能量的主要来源，稳定的GLU水平是机体组织维持正常生理机能的关键。TG是血脂的组成成分，可为细胞代谢提供能量，反映机体脂类代谢程度。本试验中，LPM添加组克氏原螯虾血清GLU和TG含量与对照组相比差异不显著，表明LPM使克氏原螯虾肝脏糖脂代谢维持正常水平。李忠琴等在云龙石斑鱼(Lactobacillus plantarum)饲料中添加1.0×105、1.0×107和1.0×109CFU/g植物乳杆菌，结果发现，各添加组TG含量与对照组相比均无显著差异，血清脂质代谢正常，与本试验结果一致。而刘辉等在花鲈基础饲料中分别添加1.0×104、1.0×106、1.0×108、1.0× 1010 CFU/mL的植物乳杆菌，结果发现，植物乳杆菌添加组的GLU含量与对照组相比无显著差异，但TG含量分别比对照组降低了1.07%、15.82%、26.28%和23.50%。这与本试验结果相反，可能与植物乳杆菌添加形式、添加量及动物种类不同有关，具体影响机制尚待进一步研究。

AST和ALT均是氨基酸转移酶，主要存于肝细胞胞浆内，是衡量肝脏受损的指标。肝细胞受损时，肝细胞内ALT和AST溢出，导致血清中AST和ALT活性升高”。本试验中，LPM添加组血清AST和ALT活性较对照组显著降低，可见添加LPM并未对克氏原螯虾的肝胰脏产生损害。本试验通过对肝胰脏组织切片观察，发现对照组和试验组的肝胰脏细胞结构完整，无损伤或病变。在饲料中添加300mg/kgLPM时，与蛋白质的消化、吸收与合成密切相关的B细胞、F细胞和R细胞数量明显多于对照组，说明添加300mg/kg LPM组消化酶分泌量较多，营养物质吸收能力和蛋白质合成能力较强。综上所述，饲料中添加LPM可改善克氏原螯虾肝脏健康，促进蛋白质合成，提高免疫能力。

3.4 LPM对克氏原螯虾肝胰脏和肠道消化酶活性的影响

消化酶活性是反映甲壳类对营养物质消化吸收的重要指标，与动物机体对营养物质的消化率呈正相关。有研究表明，植物乳杆菌在一定程度上可以刺激动物机体分泌消化酶，提高消化酶活性，促进动物机体对营养物质的消化吸收。动物体内消化酶主要有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等。尼罗罗非鱼饲料中添加1×108 CFU/g植物乳杆菌可显著提高蛋白酶和a-淀粉酶活性。在饲料中添加1.0×107CFU/g植物乳杆菌，云龙石斑鱼肠道糜蛋白酶和脂肪酶活性显著提高61%、167%，而淀粉酶活性无显著变化。在饲料中分别添加0.5×107、1.0×107、2.0 ×107CFU/g植物乳杆菌，凡纳滨对虾肠道脂肪酶活性显著提高，蛋白酶活性也有所升高。在饲料中添加1.0×108CFU/g植物乳杆菌W21可显著提高乌鳢(Channaargus)肠道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性。本研究中，在饲料中添加600mg/kg LPM，克氏原螯虾肝胰脏和肠道蛋白酶活性、肠道淀粉酶活性显著高于对照组，而肝胰脏和肠道脂肪酶活性、肝胰脏淀粉酶活性则显著降低。本研究结果与前人结论不完全一致。由此可见，在不同水产动物饲料中添加植物乳杆菌可在一定程度上提高动物体内蛋白酶活性，但对脂肪酶和淀粉酶活性影响不一致，与植物乳杆菌的添加形式、添加量和动物种类有关。本研究中，在饲料中添加600mg/kgLPM，克氏原螯虾肝胰脏和肠道蛋白酶活性较对照组显著提高，可催化更多蛋白质水解形成机体易消化吸收的氨基酸和小分子多肽，提高了蛋白质的消化率，LPM-600组蛋白质效率、蛋白质沉积率和全虾粗蛋白质含量均显著高于对照组的结果也证明了这一结论。

4 结论

本研究结果显示，饲料中添加300mg/kgLPM可实现用3%面粉替代3%花生粕，降低饲料蛋白1.5%；饲料中添加600mg/kg的LPM可提高克氏原螯虾肝胰脏和肠道蛋白酶活性，改善肠道健康和肝胰脏功能，有效促进饲料蛋白质的利用和沉积，提高了克氏原螯虾的生长性能和非特异性免疫性能。

 

参考文献：略

作者：石英，田娟，刘晶晶等，发表于《饲料研究》，2024年第四期，49-56。