灭活植物乳杆菌对肉鸡生长性能和肠道健康的影响
摘要:试验旨在研究日粮中添加灭活植物乳杆菌制剂对肉鸡生长性能和肠道健康的影响。选用336只体重均匀的1日龄雄性AA+肉鸡随机分为对照组、灭活植物乳杆菌组(0.3g/kg，有效菌数≥1.5×10个/g)和抗生素组(维吉尼亚霉素有效含量6.4mg/kg)。每组8个重复，每重复14只鸡，试验期为42d。结果表明:与对照组相比，日粮中添加灭活植物乳杆菌具有改善42日龄肉鸡体重和体增重的趋势(0.05<P<0.10)；添加灭活植物乳杆菌增加了42日龄肉鸡回肠绒毛高度以及空肠和回肠的绒毛高度/隐窝深度比值(P<0.05)，降低了回肠隐窝深度(P<0.05)；添加灭活植物乳杆菌上调了肉鸡回肠黏膜Mucin-2基因的表达(P<0.05)，降低了回肠Claudin-1和空肠Occludin基因的表达(P<0.05)；添加灭活植物乳杆菌富集了42日龄肉鸡回肠中乳酸杆菌属和木质杆菌属微生物，降低了肉鸡回肠中产气荚膜梭菌的相对丰度，并下调了回肠黏膜IL-1β基因的表达(P<0.05)。可见，在日粮中添加热灭活植物乳杆菌有利于提高42日龄肉鸡回肠黏蛋白的分泌，改善小肠形态结构，促进肠道有益菌群增殖，抑制病原菌，缓解肠道炎症，从而对肉鸡的生长性能起到积极作用。
关键词:植物乳杆菌；肉鸡；生长性能；肠道健康；肠道菌群
提高饲料效率和生长性能是家禽生产的关键目标，肠道健康是保障畜禽生长的重要因素，关系到机体的营养物质吸收和免疫调节功能。在饲料禁抗的背景下，可以通过添加益生菌、益生元、酶制剂等产品替代抗生素来改善动物肠道健康，保障其生长性能。益生菌是活体微生物的培养物，当施用足够数量时可以有效预防腹泻，提高养分利用率。研究发现，日粮中添加植物乳杆菌可以减轻炎症反应，与病原体拮抗竞争并减少其定植，对宿主的健康起到积极作用。在实际应用中，益生菌的品种与剂量、储运条件、胃肠道环境以及宿主的生理状态都会对益生菌的作用效果产生显著影响。但越来越多的研究发现，使用活菌存在感染菌血症以及传递耐药性的风险，而灭活益生菌产品也可以产生类似活菌的有益反应，并且安全性更好，更耐储运。另外，灭活益生菌主要作用成分为细菌素以及上清液提取物。植物乳杆菌所产生的细菌素具有广泛的抗菌特性与环境耐受性，具备良好的研究价值。目前关于灭活植物乳杆菌的饲喂效果尚待研究。本试验旨在研究灭活植物乳杆菌对肉鸡的生长性能、肠道形态、屏障功能以及回肠微生物的影响，揭示灭活乳酸菌及其代谢物的影响与作用机制。
1 材料与方法
1.1 试验设计
将体重均匀的336只1日龄雄性AA+肉鸡(北京家禽育种公司)随机分成3组，每组设置8个重复，每重复14只鸡。对照组饲喂基础日粮，灭活植物乳杆菌(Inactive Lactobacillus plantarum)组在基础日粮中添加0.3g/kg热灭活植物乳杆菌制剂(有效菌数≥1.5×1010个/g，由北京好实沃生物技术有限公司提供)。植物乳杆菌的发酵条件:温度36.5～37.5℃，发酵罐转速50～80r/min，发酵16～18h后80℃灭活处理。抗生素组在基础日粮中添加6.4mg/kg维吉尼亚霉素。饲料参考AA+肉鸡营养需要量配制，基础日粮配方见表1。
表1基础日粮配方及营养成分
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项目 |
0-3周龄 |
4-6周龄 |
项目 |
0-3周龄 |
4-6周龄 |
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原料组成，% |
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营养成分 |
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玉米 |
36.00 |
34.70 |
代谢能，MJ/kg |
12.25 |
13.01 |
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大豆粕 |
29.00 |
25.70 |
粗蛋白，% |
22.53 |
21.06 |
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玉米蛋白粉 |
4.00 |
4.00 |
赖氨酸，% |
1.34 |
1.16 |
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新小麦 |
17.30 |
20.00 |
蛋氨酸+胱氨酸，% |
0.94 |
0.84 |
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小麦麸 |
5.00 |
5.00 |
苏氨酸，% |
0.84 |
0.82 |
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羽毛粉 |
0.80 |
0.60 |
钙，% |
0.95 |
0.93 |
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大豆油 |
3.50 |
6.00 |
非植酸磷，% |
0.39 |
0.34 |
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磷酸氢钙 |
1.65 |
1.40 |
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石粉 |
1.20 |
1.30 |
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食盐 |
0.30 |
0.30 |
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复合多维 |
0.03 |
0.03 |
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复合矿物质 |
0.20 |
0.20 |
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氯化胆碱（50%） |
0.20 |
0.10 |
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抗氧化剂（乙氧基喹啉（65%）） |
0.02 |
0.02 |
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L-苏氨酸（98%） |
0.03 |
0.07 |
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L-赖氨酸盐酸盐（78%） |
0.50 |
0.38 |
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DL-蛋氨酸（98%） |
0.24 |
0.17 |
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植酸酶10000U/g |
0.03 |
0.03 |
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注:①每千克日粮提供：维生素A12500IU，维生素D32500IU，维生素E30IU，维生素K32.65mg，维生素B12mg，维生素B26mg，维生素B120.025 mg，生物素 0.0325mg，叶酸1.25mg,烟酸50mg，泛酸12mg，铁80mg、铜8mg，锰100 mg，锌75mg，碘0.35mg，硒0.15mg，②营养成分均为计算值。
1.2 饲养管理
饲养试验于中国农业大学涿州养殖基地进行。肉鸡按常规饲喂方式进行饲养，每日人工饲喂4～6次，确保饲料新鲜，避免浪费,乳头饮水器自动饮水，定期进行消毒和清理，饲养管理按照肉鸡饲养手册进行。饲养密度:0～3周20只/m2，4～6周18.6只/m2。
1.3 检测指标
1.3.1 生产性能
记录每只鸡的初始体重，并测定自由采食状态下肉鸡42日龄体重和耗料量，计算肉鸡平均采食量、体增重、耗料增重比，并对死亡鸡进行称重用于校正平均采食量。
1.3.2 样品采集与检测
42日龄时，每笼挑选1只与平均体重接近的肉鸡进行麻醉。剪取空肠和回肠中部0.5cm左右肠段，用生理盐水冲洗，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，将组织样品脱水，石蜡包埋，制成5μm的切片，并用苏木精和伊红染色，在光学显微镜下观察其形态结构，测量绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD)，并计算其比值(VCR)。收集空肠和回肠的部分肠段，刮取黏膜。按照TAKARA(Japan)提供的说明书使用Trizol试剂提取肠道黏膜中的总RNA，接着使用PrimeScriptTMRT reagent试剂盒(TAKARA，Japan)将提取的总RNA反转录成cDNA，然后将1μL cDNA与5 μL SYBR Greenmix，0.4μL上、下游引物，0.2μL correction fluid ROX(TAKARA，Japan)，以及3μL DEPC溶液混合，于qPCR仪中进行实时荧光定量PCR，基因的相对表达量使用2-△△Ct方法进行计算。目标基因的引物序列见表 2。收集回肠末端食糜，置于无菌EP管中，立即使用液氮进行冻存，-80℃冷冻保存后送北京诺和致源生物有限公司进行16S rRNA扩增子测序。
1.4 统计分析
数据采用Excel软件进行汇总统计，利用SPSS2.0 one-Way Annova进行单因素方差分析统计分析，并进行Duncan's多重比较。P<0.05表示差异显著，0.05<P<0.10 表示差异有显著趋势。
2 结果
2.1 添加灭活植物乳杆菌对肉鸡生长性能的影响
如表3 所示，与对照组相比，添加灭活植物乳杆菌对0～21日龄肉鸡的生长性能均无显著影响，但有提高肉鸡42日龄体重和0～42日龄体增重的趋势(0.05<P<0.10)。此外，抗生素组肉鸡21日龄的体重以及0～21日龄的体增重和采食量高于灭活植物乳杆菌组(P<0.05)，但2组肉鸡全期的生长性能无显著差异。
表3添加灭活植物乳杆菌对肉鸡生长性能的影响
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处理 |
0-21日龄 |
0-42日龄 |
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初始体重，g |
体重，kg |
体增重，kg |
采食量，kg |
料重比 |
体重，kg |
体增重，kg |
采食量，kg |
料重比 |
|
|
对照组 |
41.4±0.7 |
0.73±0.03b |
0.69±0.03b |
1.03±0.02b |
1.50±0.04 |
2.53±0.06b |
2.49±0.06b |
3.93±0.01 |
1.64±0.10 |
|
试验组 |
41.4±0.6 |
0.73±0.03b |
0.69±0.03b |
1.03±0.03b |
1.49±0.02 |
2.63±0.09ab |
2.59±0.09ab |
3.93±0.12 |
1.59±0.08 |
|
抗生素组 |
41.5±0.6 |
0.77±0.03a |
0.73±0.03a |
1.08±0.03a |
1.48±0.04 |
2.67±0.14a |
2.63±0.14a |
4.03±0.13 |
1.58±0.05 |
|
P值 |
0.908 |
0.014 |
0.014 |
0.01 |
0.696 |
0.09 |
0.09 |
0.208 |
0.107 |
注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，无字母或含相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。
2.2 添加灭活植物乳杆菌对肉鸡肠道屏障功能的影响
如图1所示，与对照组和抗生素组相比，添加灭活植物乳杆菌上调了42日龄肉鸡回肠Mucin-2基因的表达(P<0.05)，下调了空肠Occludin基因的表达(P<0.05)。与对照组相比，添加抗生素提升了回肠ZO-1基因的表达水平(P<0.05)。此外，相较于对照组，灭活植物乳杆菌组和抗生素组都降低了回肠Claudin-1基因的表达（P<0.05）。
2.3 添加灭活植物乳杆菌对肉鸡肠道形态的影响
如图2所示，与对照组相比，添加灭活植物乳杆菌增加了肉鸡空肠VCR以及回肠VH和VCR(P<0.05)，而降低了回肠CD(P<0.05)，抗生素组CD值也出现了降低。
2.4 肉鸡回肠微生物多样性分析
如图3所示，各组肉鸡回肠微生物Shannon、Simpson指数、Chao1和ACE指数均差异不显著，但灭活植物乳杆菌组Observed Species 指数低于对照组(P<0.01)。
2.5 属水平微生物相对丰度分析
属水平相对丰度排名前15的物种如图4A所示。其中相对丰度较高的微生物是肠球菌属(Enterococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、木质杆菌属(Ligilactobacillus)、柠檬乳杆菌(Limosilactobacillus)。值得一提的是，在属水平相对丰度排名前15的微生物中发现了梭状芽孢杆菌(Clostridium senus stricto)，进一步分析发现，对照组肉鸡回肠产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)的相对丰度高于灭活植物乳杆菌组和抗生素组(图4E)。此外，通过T-Test对属水平微生物的组间差异进行分析(图4B、4C、4D)发现，灭活植物乳杆菌组木质杆菌属(Ligilactobacillus)微生物丰度高于对照组和抗生素组(P<0.05)，且肠球菌属(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)、志贺氏大肠杆菌(Escherichia Shigella)的相对丰度低于对照组(P<0.05)，抗生素组木质杆菌属(Ligilactobacillus)的相对丰度也高于对照组(P<0.05)。
2.6 LEFSe分析
不同处理组肉鸡回肠微生物菌群的 LEFSe分析结果如图5所示。对照组肉鸡回肠中显著富集的微生物为偶氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、头孢肠球菌(Enterococcus cecorum)、大肠杆菌(Escherichia coli)，灭活植物乳杆菌组肉鸡回肠中显著富集杆菌属的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviarius)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，而抗生素组肉鸡回肠中显著富集的微生物为巴氏杆菌(Barnesiella)。
2.7 肠道炎症
如图6所示，与对照组相比，灭活植物乳杆菌组和抗生素组肉鸡空肠和回肠IL-1β基因的表达量均降低(P<0.05)。灭活植物乳杆菌组肉鸡肠道IL-6基因的表达与对照组无显著差异，但空肠TNF-a基因的表达量升高(P<0.05)。值得注意的是，灭活植物乳杆菌组肉鸡空肠IL-10基因表达降低(P<0.05)，回肠IL-10基因表达相对升高(P>0.05)。
3 讨论
3.1 添加灭活植物乳杆菌对肉鸡生长性能与肠道形态结构的影响
益生菌在提高家禽生长、抑制病原体和改善免疫力方面具有与抗生素相当的作用效果。相较于活体益生菌在安全性和运输储存上的劣势，灭活益生菌兼顾安全和高效，并且可以通过调整关键成分的用量达到良好效果，成为了更有针对性的新一代产品。此前已有研究证实灭活乳酸菌可以提高饲料转化率和肉鸡生长性能，增强肉鸡的抗逆性。本研究表明，添加灭活植物乳杆菌可以提高肉鸡后期增重的趋势，抗生素组前期的体重、体增重和采食量显著高于灭活植物乳杆菌组，但两者全期的生长性能无显著差异。类似的研究也发现，灭活植物乳杆菌可以增加养分的吸收面积，提高肉鸡生长速率，对全期肉鸡体重、日增重和饲料转化率有显著的积极影响。营养吸收与生长性能表现有直接关系，而VH、CD、VCR与肠道的吸收能力高度相关，可以反映出肠道的发育状况。在本试验中，灭活植物乳杆菌显著增加了肉鸡回肠VH、VCR，降低了回肠CD。Khonyoung等也发现，日粮中添加热灭活乳酸菌可以加速十二指肠上皮细胞更新，减少回肠绒毛的脱落，提高吸收能力。
3.2 添加灭活植物乳杆菌对肉鸡肠道屏障与炎症的影响
肠道中的黏液层是重要的化学屏障，由杯状细胞产生，其主要成分是黏蛋白。由本试验可知，添加灭活植物乳杆菌显著增加了回肠Mucin-2 基因的表达，说明黏蛋白的分泌增加，有助于维护黏液屏障，提升肠道健康度。肠上皮细胞的紧密连接(TJ)也是肠道屏障的重要组成部分，主要由闭合蛋白(Claudins)、闭锁蛋白(Occludin)、紧密连接黏附因子(JAM)等跨膜蛋白以及闭合小环蛋白(ZOs)等构成，参与调节上皮细胞极性和细胞间隙中溶质和液体的运动，通过细胞间连接实现其屏障作用，与营养吸收、机体免疫等功能密切相关。ZO-1是肠上皮细胞紧密连接的结构基础，影响肠道通透性，参与信号传导。Occludin的功能涉及细胞间黏附、移动和通透性，而Claudin-1则可使细胞紧密连接变紧，减少细胞旁通透性。本研究发现，与对照组和抗生素组相比，添加灭活植物乳杆菌显著上调了肉鸡回肠ZO-1基因的表达，显著下调了空肠Occludin 基因的表达。另外，相较于抗生素组，灭活植物乳杆菌对ZO-1的提升较小，但与对照组相比，二者都显著降低了回肠Claudin-1基因的表达。荟萃分析显示，益生菌的使用可以促进Z0-1 mRNA的表达，有助于保障肠道屏障屏障完整性。此外，研究发现ZO-1有助于稳定肌动蛋白细胞骨架的Claudin分子链，可以直接与Occludin结合，对肠道黏膜的修复起到重要作用。根据Claudin-1基因与Occludin基因表达的下调，黏蛋白分泌的增多以及肉鸡生长性能的提高，推测肠道通透性可能有轻微增加，刺激了黏膜修复，对肠道的吸收起到积极影响。
白介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-a)等促炎细胞因子是重要的炎症诱导信号，可以放大炎性反应，而IL-10则是抗炎细胞因子，可以限制过度炎症反应、上调先天性免疫并促进组织修复。有研究发现，乳酸菌及其代谢产物可以通过抑制某些信号途径对炎性因子进行调控，降低促炎细胞因子的表达，从而发挥抗炎作用，并抑制由炎症引起的TJ结构变化来缓解肠道屏障损伤。本研究发现，灭活植物乳杆菌对IL-1β和IL-10具有较强的抑制作用，但增加了TNF-a的表达，而对IL-6无明显影响。以上结果出现矛盾，可能与灭活乳酸菌的作用机制以及TJ蛋白和炎性因子表达的复杂性有关，需要进一步探索。
3.3 添加灭活植物乳杆菌对肉鸡肠道微生物的影响
本试验收集并检验了回肠末端的食糜，发现不同组的肠道微生物存在显著差异。对照组中偶氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、大肠杆菌(Escherichia coli)和梭菌属(Clostridium)较为突出,其中产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)显著高于其他组。灭活植物乳杆菌组中乳酸杆菌(Lactobacillus)的相对丰度达到80%以上，显著高于其余2组，并且肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)、志贺氏大肠杆菌(Escherichia Shigella)以及梭菌属(Clostridium)的相对丰度显著低于CT组。研究发现，产气荚膜梭菌是肉鸡坏死性肠炎的主要病原，当菌群失调时会产生毒素，引起腹泻、痉挛等症状，发病迅速，严重时可导致肉鸡死亡，而肠球菌属和志贺菌属则是肉鸡感染痢疾的主要诱因。据研究可知，植物乳杆菌分泌的细菌素具有广泛的抑菌效果，对大肠杆菌、肠沙门氏菌、副溶血弧菌具有非常强的抑菌活性，对于金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等革兰阳性菌也具有一定的抑制作用，可以作为替抗产品用于预防坏死性肠炎等多种胃肠道疾病，减少毒素的产生，稳定胃肠道环境。另外，由于植物乳杆菌的细菌素对乳酸菌均无抑菌活性，可以增加同属微生物(乳酸菌)的数量，而乳酸菌是肠道的有益菌，可以通过分泌乳酸，提高肠道内丁酸浓度，降低pH，减少血液中的胆固醇，有效防治痢疾、急性败血症和坏死性肠炎的发生，有利于肉鸡胃肠道健康。综合分析，虽然灭活植物乳杆菌导致了肠道微生物多样性的下降，但也改变肠道微生物菌群结构，促进了肠道优势有益菌种(主要为乳酸菌)的建立，抑制病原菌(如产气荚膜梭菌和大肠杆菌)增殖，并且与抗生素组相比减少了Barnesiella(巴氏杆菌)这一潜在病原的数量，对维持良好的肠道菌群起到积极作用。
4 结论
本研究结果表明，灭活植物乳杆菌能够提高肉鸡肠道有益菌丰度，抑制有害微生物增殖，在一定程度上促进肠道发育，增加黏蛋白Mucin-2的分泌，有助于维持肠道屏障功能，降低炎性因子IL-1β的表达，起到减轻炎症的作用，对提高肉鸡生长性能具有积极影响，有一定替代抗生素的潜力。
参考文献：略。
作者：万瑾怡，袁建敏发表于《科技技术》2023年第10期。
