不同发酵条件对乳酸片球菌活性的影响
摘要：乳酸片球菌是一种可以合成片球菌素的革兰氏阳性菌，因其优良的抑菌效果，在农业和食品行业有广泛的应用前景。本研究以实验室保藏的一株乳酸片球菌为实验菌种，以MRS为基础培养基进行发酵，筛选最适合其生长的C源和pH值，为乳酸片球菌的工业化生产提供参考。实验结果表明，乳酸片球菌的最佳C源是葡萄糖，最适生长p H值为6.0。
关键词：乳酸片球菌，片球菌素，发酵，工业化生产
乳酸片球菌发现于蔬菜和牛乳中，对植物或动物不致病；是硬壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，气球菌科，片球菌属（Pediococcus）；细胞呈现圆球形，革兰氏染色阳性，无运动能力，不形成芽胞和色素，兼性厌氧。在MRS固体培养基上，菌落表面光滑，呈乳白色，直径大小一般为1.0～2.5 mm，适宜片球菌属生长温度范围为 25～40°C。
乳酸片球菌可以发酵合成片球菌素，是一种通过核糖体合成机制产生具有抑菌特性的小分子多肽，是一种热稳定性和耐酸性较好的多肽[1]。因片球菌素良好的抑菌效果，能有效的抑制致病菌和腐败菌的生长，乳酸片球菌在农业和食品业具有广泛的研究价值和应用前景。目前，乳酸片球菌主要应用于饲料中，可以提高适口性和消化率[2]。同时，乳酸片球菌还可用于肉制品发酵，提高营养价值并赋予独特风味[3]。
为实现乳酸片球菌的工业化生产，需对其进行高密度发酵培养的研究。影响菌体密度和发酵产物表达的主要因素有C源、氮源、维生素和微量元素等，此外，发酵培养的温度、pH值等也对微生物的生长起到关键作用[4]。研究表明，乳酸片球菌的最适生长温度为37℃，最佳接种量为5%~6%，培养10h达到稳定期。目前用于乳酸片球菌培养的常用培养基有TGE和MRS培养基[5]。本文以MRS培养基为基础培养基，利用一株分离得到的乳酸片球菌进行发酵培养，研究其生长所需最佳的C源和最适pH值。
1 实验材料与方法
1.1 菌种
乳酸片球菌 HEW-A932，由北京好实沃生物技术有限公司提供。
1.2 培养基
MRS液体培养基（g/L）：蛋白胨 10g 、牛肉膏 10g、酵母膏 5g、葡萄糖 20g、柠檬酸氢二铵 2g、无水乙酸钠 5g、 MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.1H2O 0.25g、K2HPO4.3H2O 2g、吐温-80 1mL、 pH=7.0 ，121℃ 灭菌30min。
MRS固体培养基：MRS液体培养基中加入1.6%的琼脂粉，121℃ 灭菌30min。
1.3 实验设备
无菌超净工作台SW-CJ-2D（上海沪净医疗器械有限公司），培养箱SHP-150（上海精宏实验设备有限公司），摇床HZP-250（上海精宏实验设备有限公司），离位灭菌发酵罐-5L（上海保兴生物设备工程有限公司）。
1.4 实验方法
1.4.1 活菌数的测定
用灭菌后的0.85%生理盐水将样品按10倍梯度稀释至一定倍数后，取1mL稀释液用MRS固体培养基倾注倒板，37℃培养48h后计数，每个样品设3个平行，结果以cfu/mL表示。
1.4.2 种子制备
取乳酸片球菌的甘油管1支，用接种环划线至MRS固体板上，37℃培养48h长出单菌落。接单菌落于 50mL MRS液体培养基中，于37℃ 130rpm培养20h，取10mL菌悬液接种于 150mL MRS液体培养基中，37℃ 130rpm培养7h得乳酸片球菌种子液。
1.5 不同pH值对乳酸片球菌活性的影响
以MRS培养基为基础培养基，配制3.5L MRS培养基装入5L发酵罐，121℃灭菌30min后调初始pH为7.0，以5%的接种量接入乳酸片球菌种子液，温度控制为37℃，转速300rpm。分别控制发酵pH值为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，发酵培养12h，检测不同pH条件下的活菌数（cfu/mL），根据活菌数确定乳酸片球菌的最适生长pH。
1.6 不同C源对乳酸片球菌活性的影响
以MRS培养基为基础培养基，分别以葡萄糖、蔗糖和麦芽糊精为C源，配制3.5L MRS培养基装入5L发酵罐，121℃灭菌30min后调初始pH为7.0，以5%的接种量接入乳酸片球菌种子液，温度控制为37℃，转速300rpm，pH控制为6.0，培养12h，检测不同C源条件下的活菌数（cfu/mL），根据活菌数确定乳酸片球菌的最佳C源。
2. 结果与分析
2.1 pH值对乳酸片球菌活性的影响
乳酸片球菌对生长环境的pH值较敏感，由于代谢产物的积累，pH值降低，导致菌体繁殖速度降低，甚至细胞裂解。从上图可以看出，发酵的pH值对活性影响显著，pH 6.0为乳酸片球菌最佳生长pH，发酵12h的活性达到6.63×109cfu/mL。
2.2 C源对乳酸片球菌活性的影响
由于不同微生物之间酶系表达量的不同，故不同微生物对碳水化合物的代谢能力也不同。乳酸片球菌对单糖的利用率较高。实验结果表明，pH控制6.0，以葡萄糖为C源的实验组活性最高。因此，葡萄糖是其生长的最佳C源。
3 结论
本文以MRS为基础培养基，研究一株乳酸片球菌生长所需的最佳C源和最适pH值。实验用5L发酵罐，3.5L装液量对乳酸片球菌进行发酵培养12h，分别控制发酵pH为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，实验表明，pH 6.0为乳酸片球菌的最适生长pH，活性可达6.63×109cfu/mL。分别以葡萄糖，蔗糖和麦芽糊精为C源进行发酵培养，实验表明，乳酸片球菌的最佳C源为葡萄糖，与其他两种C源相比，活性有明显提升。本研究明确了乳酸片球菌的最佳C源为葡萄糖，最适生长pH为6.0，为该菌种规模化生产提供了参考。
参考文献
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[2]杨华, 张亚杰, 马俪珍. 发酵剂及抗氧化剂对鲶鱼发酵香肠品质的影响[J]. 食品与发酵工业, 2010, 036(009):166-171.
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[5]韩雪, 周志江. 乳酸片球菌细菌素的活性及特性的研究[J]. 食品研究与开发, 2006, 27(004):19-21.
