通过紫外诱变提高屎肠球菌生产性能的研究
摘 要：饲用屎肠球菌在动物养殖中具有很重要的作用，为了提升其发酵生产性能，以屎肠球菌HEW-A501为出发菌株，通过紫外诱变选育出生长良好、活性较高、性状稳定且具有工业生产价值的屎肠球菌菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27，与出发菌株HEW-A501相比，其生长速率、活性均有显著性提高。
关键词：紫外诱变，屎肠球菌，发酵生产
菌种是发酵企业核心竞争力，菌种决定一个发酵产品的有无，菌种在发酵生产企业中有着非常重要的作用。生产菌种的性能是生产优质发酵产品的关键指标，发酵性能通常从活性、产酸能力、抑菌性能等方面来进行评价。屎肠球菌作为消化道内的优势菌群，具有较强的耐受性和定植能力[1]，是一种兼性厌氧化能异养乳酸菌，适合于生产和应用。屎肠球菌能够促进动物营养物质的吸收，并能够有效抑制肠道中致病菌和腐败菌的繁殖，从而达到预防肠道感染和防止腹泻的效果，还能提高动物的免疫力[2]。因此筛选发酵性能良好的屎肠球菌菌种，已成为新型微生态制剂的菌种的热点。
诱变育种是通过物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，提高其突变率，从中筛选出符合育种目的的菌株，为生产或科学研究用[3]。在物理诱变剂中紫外线使用最广[4]，因此本研究采用紫外诱变对屎肠球菌HEW-A501进行诱变，筛选出高活性菌株，为新型微生态制剂提供优良菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
屎肠球菌HEW-A501，由好实沃生物研发中心筛选鉴定获得。
1.1.2 培养基
培养基Ⅰ：蔗糖2.5%，大豆蛋白胨1.8%，酵母膏0.4%，氯化镁0.171%，硫酸锰0.045%，氯化钠0.2%，碳酸钙0.0625%，pH7.0±0.2。
培养基Ⅱ：胰蛋白胨2%，酵母膏0.5％，氯化钠0.5%，柠檬酸三钠0.1%，柠檬酸铁铵0.05％，pH7.0±0.2。
培养基Ⅲ：蛋白胨2 %，酵母浸膏0. 5%，葡萄糖0.2 %，磷酸氢二钠%，磷酸氢二钾0.4%，pH7.0±0.2。
MRS培养基：蛋白胨1%，葡萄糖2%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，乙酸钠0.5%，磷酸氢二钾0.2%，柠檬酸氢二氨0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸锰0.025%，吐温80 0.1%，pH 7.0±0.2。
1.2 主要仪器和设备
CBIO-UV4型紫外诱变仪（北京赛百奥科技有限公司），L5型紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司），水平流HS型HS-840/1300超净工作台（苏州尚田洁净技术有限公司），ME104E型分析天平（上海微川精密仪器有限公司），YAMATO 高压蒸汽灭菌器SQ510C（上海人和科学仪器有限公司）等。
1.3 方法
1.3.1 屎肠球菌HEW-A501生长曲线测定
将菌种HEW-A501按1%（V:V）的接种量接种于培养基Ⅰ，37℃，180r/m震荡培养24h，每2h取样，用分光光度计检测HEW-A501发酵液的OD值，以未接种的培养基Ⅰ作为空白对照，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制屎肠球菌HEW-A501的生长曲线[5]。
1.3.2 紫外诱变的菌悬液制备
取活化后的HEW-A501菌液转接至MRS液体培养基中，37℃，震荡培养至对数生长期中期，用移液管取出菌液10mL，3000r/min离心15-20min，去上清液，收集菌体，用10mL的生理盐水多次洗涤，洗净残留的培养基，然后将细胞重新悬浮在生理盐水中，调节细胞浓度为107cfu/mL，制成HEW-A501细胞悬浮液。
1.3.3 紫外诱变屎肠球菌HEW-A501
取菌悬液0.1mL于MRS平板上，涂布均匀，根据经验放到距离功率为30W的紫外灯管30cm处，为了稳定光波可，照射前应先开启紫外灯预热20min，然后打开培养皿盖，开启紫外灯进行诱变照射，照射时间分别为0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、80、100、120s，关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用黑布包好平板，于37℃暗培养2～3d，培养后统计生长菌落数，以未经诱变的平板作为对照，计算存活率、致死率[6]。
致死率（%）=（对照组的菌数-诱变后的菌数）/对照组的菌数×100%
1.3.4 屎肠球菌高活性菌株的筛选
从致死率80%的突变菌株平板上挑取菌落较大、生长快的菌落，将原始菌株及筛选获得的25株诱变后菌株分别接种于液体培养基Ⅰ中，37℃，180r/m震荡培养12h后，检测发酵液中的活菌数，发酵液中活菌数最高的菌株即为高活性突变株。为了验证变异菌株高活性，利用不同的发酵培养基（MRS培养基、培养基Ⅱ和培养基Ⅲ）进行，检测发酵液中活菌数，
1.3.5 发酵液活菌检测
发酵液活菌检测采用菌落计数法，取培养后发酵液0.5mL于4.5mL灭菌生理盐水中，混匀，此为10-1菌悬液，一次进行梯度稀释至10-7、10-8，分别取稀释至10-7、10-8的发酵液1mL于灭菌培养皿中，每个稀释度做三个平行，然后加入冷去至45℃左右的MRS培养基，轻轻摇匀，待冷却后置于37℃恒温培养24-48h，计数。
1.3.6 高活性突变株的遗传稳定性试验
将获得的高活性突变株，连续传代5代以上，接种于发酵培养基Ⅰ中，分别检测其活性。
2 结果与分析
2.1 HEW-A501的生长曲线
用于诱变处理的菌种一般处于对数生长期，对数生长期的菌体生长比较同步，且容易变异、重复性好，这样也保证了处理时菌体具有一定的细胞浓度，还能增加可能变异的细胞数, 因此常选用对数生长中后期的菌体细胞供诱变处理。选用对数生长中后期10h的菌液作为菌悬液，用于诱变处理（图1）。
图1 屎肠球菌HEW-A501的生长曲线
2.2 紫外诱变时间对HEW-A501致死率的影响
紫外诱变处理微生物，微生物吸收射线的剂量一般取决于紫外灯的功率、照射距离及照射时间。本试验根据经验采用30W紫外灯，照射距离为30cm，一般微生物的营养体3-5min即可致死，而革兰氏阳性菌只需0.5-2.0min就可死亡[5]。不同照射时间的紫外诱变致死率如图2所示。
紫外诱变时间一般选择致死率为90%~99%的照射剂量，有研究表明[7~8]致死率为99%时，可使菌体发生最大程度的突变，但有研究表明一般紫外诱变的正突变主要出现在低剂量诱变中，所以目前致死剂量一般选择80%~90%的照射剂量，甚至更低即70 %~80 %的致死率剂量[9]。综合考虑，本实验中选择在30W紫外灯，菌悬液距紫外灯管30cm下，紫外诱变剂量为50s。
图2 屎肠球菌HEW-A501不同照射时间的紫外诱变致死率
2.3 紫外诱变结果
通过30W紫外照射50s对屎肠球菌HEW-A501进行诱变，从初筛平板上挑取菌落较大的菌落进行分离纯化，37℃恒温培养, 复筛时选择生长较快的菌株，测定发酵液的pH，结果如表1所示。综合考虑菌株的生长时间和pH，选择HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27作为高活性诱变菌株。
表1 屎肠球菌HEW-A501诱变结果
|
菌株 |
长出时间（h） |
pH |
活菌数（亿cfu/mL） |
|
HEW-A501 |
20 |
4.68 |
15.2 |
|
HEW-A501Z1 |
20 |
4.51 |
15.4 |
|
HEW-A501Z2 |
21 |
4.62 |
15.7 |
|
HEW-A501Z3 |
19 |
4.55 |
16.8 |
|
HEW-A501Z4 |
18 |
4.43 |
17.5 |
|
HEW-A501Z5 |
23 |
4.68 |
14.3 |
|
HEW-A501Z6 |
20 |
4.57 |
15.6 |
|
HEW-A501Z7 |
17 |
4.55 |
12.3 |
|
HEW-A501Z8 |
10 |
4.15 |
22.4 |
|
HEW-A501Z9 |
16 |
4.43 |
19.7 |
|
HEW-A501Z10 |
17 |
4.52 |
18.6 |
|
HEW-A501Z11 |
15 |
4.39 |
20.1 |
|
HEW-A501Z12 |
15 |
4.35 |
24.8 |
|
HEW-A501Z13 |
22 |
4.67 |
13.4 |
|
HEW-A501Z14 |
20 |
4.55 |
16.3 |
|
HEW-A501Z15 |
21 |
4.54 |
15.4 |
|
HEW-A501Z16 |
18 |
4.39 |
20.4 |
|
HEW-A501Z17 |
19 |
4.47 |
19.6 |
|
HEW-A501Z18 |
18 |
4.31 |
20.5 |
|
HEW-A501Z19 |
17 |
4.38 |
19.5 |
|
HEW-A501Z20 |
19 |
4.54 |
17.8 |
|
HEW-A501Z21 |
13 |
4.18 |
24.8 |
|
HEW-A501Z22 |
16 |
4.29 |
20.7 |
|
HEW-A501Z23 |
18 |
4.37 |
18.8 |
|
HEW-A501Z24 |
20 |
4.58 |
16.4 |
|
HEW-A501Z25 |
21 |
4.66 |
16.0 |
|
HEW-A501Z26 |
17 |
4.53 |
11.3 |
|
HEW-A501Z27 |
12 |
4.11 |
26.5 |
|
HEW-A501Z28 |
18 |
4.63 |
8.9 |
|
HEW-A501Z29 |
21 |
4.21 |
15.6 |
|
HEW-A501Z30 |
18 |
4.38 |
16.3 |
高活性诱变菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z28在三种不同的发酵培养基的活菌如表2所示，可知诱变菌株活性均显著高于出发菌株HEW-A501。
表2 不同培养基中高活性诱变菌株的活性
|
菌株 |
MRS培养基 活菌数（亿cfu/mL） |
培养基Ⅱ 活菌数（亿cfu/mL） |
培养基Ⅲ 活菌数（亿cfu/mL） |
|
HEW-A501 |
16.0 |
15.8 |
15.4 |
|
HEW-A501Z8 |
22.5 |
22.5 |
22.7 |
|
HEW-A501Z21 |
24.5 |
24.7 |
24.9 |
|
HEW-A501Z27 |
26.0 |
25.8 |
26.4 |
2.4 高活性菌株的遗传稳定性
将获得的高活性突变株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27，以HEW-A501作为对照组，分别连续传代5代以上。由表3可见，诱变后菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27与原始菌株HEW-A501相比，高活性诱变菌株遗传稳定性良好且活性高，可以作为下一步研究的新菌种。
表3 高活性菌株的遗传稳定性结果
|
菌株 |
HEW-A501 |
HEW-A501Z8 |
HEW-A501Z21 |
HEW-A501Z27 |
|
5代 |
15.7 |
22.1 |
24.7 |
26.2 |
|
10代 |
15.4 |
22.4 |
24.9 |
26.5 |
|
15代 |
16.0 |
22.7 |
25.0 |
25.8 |
|
17代 |
15.7 |
21.9 |
24.8 |
26.7 |
|
20代 |
16.1 |
22.6 |
24.6 |
26.3 |
|
25代 |
15.3 |
22.3 |
25.1 |
26.8 |
3结论与讨论
发酵生产的关键是菌种，首先必须具备良好的菌种基础，才能进行发酵工艺改进进而获得理想的发酵产品。诱变育种是工业生产中获得优良菌种的重要途径。本研究采用的是紫外诱变，通过30W紫外灯，照射时间50s，照射距离为30cm，筛选出高活性菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27，与出发菌株HEW-A501相比，其活性有显著提高，且产酸也有一定程度提高、稳定性好。在37℃培养时，诱变菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27
和出发菌株HEW-A501的生长速率差异不大，但稍高于出发菌株。说明变异菌株的遗传物质发生了改变，但突变机制尚不清楚，有待于进一步进行分子水平上的研究。
参考文献
- Ehrmann MA，Kurzak P，Bauer J，et al．Characterization of lactobacilli towards their use as probiotics adjuncts in poultry［J］．Journal of Applied Microbiology，2002, 92: 966-975.
- 潘宝海,孙冬岩,孙笑非,等. 不同微生物饲料添加剂对断奶仔猪生长性能的影响[J]. 饲料研究,2014,05:46-47.
- 涔沛林，蔡谨. 工业微生物学[M]. 北京：化学工业出版社，2000.
- 韩雪,张兰威,张爽,等. 弱后酸化酸奶发酵菌株的紫外诱变选育[J]. 中国酿造,2011,01:127-130.
- 吴慧昊,牛锋. 乳酸菌低温菌株的复合诱变选育[J]. 微生物学通报,2013,04:631-645.
- 刘占英,马慧芳,段申,等. 紫外诱变提高一株粪肠球菌产L-乳酸的能力[J]. 内蒙古农业大学学报(自然科学版),2013,06:5-8.
- Leslie A, Glatz BA, Hammond EG. Mutagenesis of strains of Propionibacterium to produce cold-sensitive mutants[J]. Journal of Dairy Science,1983, 66(12): 2482−2487.
- O’donovan GA, Kearney CL, Ingraham JL. Mutants of Escherichia coli with high minimal temperatures of growth[J]. Journal of Bacteriology, 1965, 90(3):611−616.
- 诸葛健.工业微生物实验技术手册[ M].北京:中国轻工出版社, 1994:145-147.
