pH调控对丁酸梭菌发酵活菌数及芽孢率的影响

摘要：本研究在50L发酵罐水平研究了不同发酵初始pH、pH调控起点，调控时间对丁酸梭菌C-103活菌数及芽孢率的影响，研究结果表明，当发酵初始pH达到6.5，pH调控起点5.5，随后控制pH维持6.0 8h，对丁酸梭菌活菌数及芽孢率影响较大，在此条件下，活菌数与芽孢率分别能够达到12亿cfu/ml及94.2%，在随后的200L罐中试实验中，发酵活菌数达到13.1亿cfu/ml，芽孢率95%，高于行业平均水平，为其规模化生产提供了一定的借鉴。

关键词：pH调控， 芽孢率，活菌数，中试

丁酸梭菌是一种，厌氧、产酸、特定条件下能够产生芽孢的，对人与动物都具有益生作用的微生物[1]。丁酸梭菌能够维持动物肠道微生态平衡[2]，并且促进肠道益生菌增殖[3]，同时，通过代谢产生有机酸如，乙酸，丙酸，丁酸等，对常见肠道致病菌如，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，艰难梭菌[4],同时，丁酸梭菌还能够减少氨气及胺的产生[5]，因此越来越多的厂家开始将丁酸梭菌作为微生态制剂添加到食品，饲料，医药等领域以发挥其多种益生作用[6]。

丁酸梭菌发酵液中活菌数及芽孢率决定了丁酸梭菌生产水平的高低，丁酸梭菌发酵水平的高低，直接决定了其微生态制剂产品质量的好坏及成本，但是，目前市售丁酸梭菌发酵水平普遍在108~109水平，少数企业发酵液经喷雾干燥后产品活性达到1010cfu/g，成品芽孢率率40~90%，但一般产量小且价格昂贵，难以满足市场需求[7]，这是由于丁酸梭菌高密度发酵技术不成熟，厌氧发酵设备结构复杂，维护成本高，严重制约了丁酸梭菌的工业化水平，同时，发酵工艺参数，培养基组分，pH，温度等也制约了其生产。

本研究以实验室最新分离到的一株丁酸梭菌C103作为实验菌株，以发酵初始pH,发酵过程pH调控作为研究对象，研究了其对丁酸梭菌发酵活菌数及芽孢率的影响。

1.       实验材料与方法

1.1 菌种

丁酸梭菌C-103，由北京好实沃生物技术有限公司分离、保藏、提供

种子培养基：RCM强化梭菌培养基

发酵培养基：葡萄糖2.0%，淀粉1.0%，酵母膏2.0%，大豆蛋白胨1.0%，柠檬酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸锰0.02%，硫酸镁0.05%，吐温-80 0.1%，碳酸钙0.1%。

1.2 培养方法

挑取丁酸梭菌单菌落接种至RCM培养基，37℃静置厌氧培养16h后，按照5.0%接种量，接种至装液量为35L的50L发酵罐内。

1.3 检测方法 

活菌数检测培养基使用亚硫酸铁琼脂，37℃厌氧培养12~16h。

芽孢检测取适量发酵液，80℃水浴处理10min后测定。

1.4 初始pH对活菌数及芽孢率的影响

将发酵培养基初始pH分别调至6.0，6.5，7.0，发酵过程不对pH进行控制至发酵结束，检测活菌数及芽孢率。

1.5 调控起点对活菌数及芽孢率的影响

发酵初始pH6.5，发酵过程中，当pH下降至6.0后，使用20%氢氧化钠调节pH分别为5.0，5.5，6.0并维持至发酵结束，发酵结束后测定活菌数及芽孢率。

1.6 pH维持时间对活菌数及芽孢率的影响

发酵初始pH6.5，发酵过程中，当pH下降至5.5后，使用20%氢氧化钠调节pH至6.0分别维持6h，8h，10h，至罐压稳定镜检芽孢数量不再增加，测定活菌数及芽孢率。

1.7 200L罐中试实验

采用两级种子方式，一级种子采用单菌落接种RCM培养基，二级种子采用RCM培养基，接种量2%，厌氧条件下37℃静置培养16~18h后以接种量5%，接种至发酵培养基，发酵培养基121℃灭菌30min，发酵过程转速50rpm/min，通入氮气保持罐压0.05Mpa，接种量5%，发酵培养基初始pH6.5，接种后，当pH下降至5.5，调节pH至6.0并维持10h，至罐压稳定，镜检芽孢率达到90%以上时停止发酵，检测活菌数及芽孢率。

2.       实验结果及讨论

2.1 发酵培养基初始pH对发酵效果的影响

图1 不同初始pH下发酵过程pH的变化            图2 不同初始pH下活菌数及芽孢率

由图1，图2可知，丁酸梭菌C-103在发酵培养基中4h后进入对数期，18h后pH稳定，对数期结束，进入稳定期，不同初始pH条件下，活菌数随着pH的升高，先升高再降低，芽孢率也呈现此现象，当初始pH达到6.5时活菌数与芽孢率均达到最大，分别为1.1×108cfu/ml及45.1%。

2.2 发酵过程pH调控对活菌数及芽孢率的影响 

            图3 不同调控pH条件下发酵过程pH变化                        图4 不同控制pH下活菌数及芽孢率

由图3，图4可知，发酵过程中当pH下降到一定程度，对pH进行控制并维持，活菌数及芽孢率随着控制pH的升高而升高，当控制pH维持在6.0至发酵结束时，活菌数及芽孢率均达到最大，分别达到9.2×108cfu/ml，芽孢率83.1%。

2.3 pH控制时间对发酵效果及芽孢率的影响

                图5 不同pH控制时间下发酵过程pH变化情况               图6 不同pH控制时间下活菌数及芽孢率

发酵8h后pH下降至5.5，开始对pH进行调控，并维持不同时间，由图可知，不同维持时间后pH均仍有不同程度下降，由此可知，菌体仍处在对数生长期，pH下降程度不同，表明了pH维持结束时间的早晚，pH维持结束过早，菌体仍处于对数期，仍会有有机酸产生，虽然，恶劣生长环境会促进芽孢生成，但是菌体受到反馈抑制，会过早形成芽孢，并且在合适的条件下萌发，所以，pH调控过程，在一定时间范围内，pH维持时间越长，越能够增加菌体含量，同时，当pH调控维持时间略短于菌体生长对数期时，一方面保证了菌体的增殖，另一方面生长环境的变化能够促进芽孢的生成，所以pH调控10h为最佳，此条件下，活菌数及芽孢率分别达到12×108cfu/ml，芽孢率94.2%。

2.4 200L罐中试发酵

200L罐发酵结果显示，接种量5%，5~6h达到对数期，pH降低至5.5后，使用20%氢氧化钠调节pH至6.0，维持10h后，当罐压不再增加，镜检目测芽孢率达到90%以上，停止发酵，活菌数13.2亿/ml，芽孢率94.2%。

3.       结论

芽孢对于芽孢生成均来说，是一种抵抗外界不利条件的手段，属于菌体的应激行为，受到微生物本身基因水平及环境因素的影响。本研究对丁酸梭菌C-103发酵过程pH调控进行了实验，来探究pH对丁酸梭菌生长及芽孢率的影响，研究结果表明，初始pH，发酵过程调控pH及调控时间，对丁酸梭菌有较大影响，当初始发酵pH6.5，发酵过程pH下降至5.5后，调节pH至6.0并维持10h，维持时间略短于菌体生长的对数期，发酵结束后活菌数达到13.1×108cfu/ml，芽孢率95%，均高于行业平均水平。

参考文献

[1].                      Li C, Wang Y, Xie G, Peng B, Zhang B, Chen W, Huang X, Wu H, Zhang B (2016) Complete genome sequence of Clostridium butyricum JKY6D1 isolated from the pit mud of a Chinese favor liquor-making factory. J Biotechnol 220:23–24. https://doi. org/10.1016/j.jbiotec.2016.01.003

[2].                       Cassir N, Benamar S, Bernard LS (2016) Clostridium butyricum: from benefcial to a new emerging pathogen. Clin Microbiol Infect 22:37–45. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2015.10.014

[3].                      Kong Q, He GQ, Jia JL, Zhu QL, Ruan H (2011) Oral administration of Clostridium butyricum for modulating gastrointestinal microfora in mice. Curr Microbiol 62:512–517. https://doi.org/10.1007/ s00284-010-9737-8

[4].                      Woo TD, Oka K, Takahashi M, Hojo F, Osaki T, Hanawa T, Kurata S, Yonezawa H, Kamiya S (2011) Inhibition of the cytotoxic efect of Clostridium difcile in vitro by Clostridium butyricum MIYAIRI 588 strain. J Med Microbiol 60:1617–1625. https://doi. org/10.1099/jmm.0.033423-0

[5].                      Zhang S, Shi Y, Zhang S, Wang H (2013) Progress on the studies and application of Clostridium butyricum. Biotechnol Bull 9:27–32. https://doi.org/10.1111/j.1745-4603.2010.00262.x

[6].                      郑有秀，王超，邹晓庭，等 .丁酸梭菌对断奶仔猪生长性 能、肠道结构和免疫功能的影响［J］.动物营养学报，2018，30 ( 7) : 2683－2689.

[7].                       Lan B，Fan Y，Dong L，et al. Specific immunotherapy plus Clostridium butyricum alleviates ulcerative colitis in patients with food allergy［J］.Scientific Ｒeports，2016，6: 25587.

[8].                      Duan Y，Zhang Y，Dong H，et al.Effect of dietary Clostridium butyricum on growth，intestine health status and resistance to ammonia stress in Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei［J］. Fish and Shellfish Immunology，2017，65: 25－33.

[9].                       吴天福,谢小林,陈美标,等.丁酸梭菌厌氧发酵机制及高密度厌氧 发酵方式研究进展[J].食品与机械,2020,36(1):2222-229.