枯草芽孢杆菌益生菌剂发酵工艺 及其稳定性研究

杜志琳  李雪平  尹望 

（北京好实沃生物技术有限公司，北京 101399）

摘 要：研究进行枯草芽孢杆菌的扩大培养，制备益生菌剂，并检测益生菌剂对模拟动物胃肠液和胆汁 的耐受性。结果表明: 枯草芽孢杆菌益生菌剂能够耐105 ℃高温10 min，且对人工胃液、肠液及胆盐的耐受 性良好，这为以后的研究提供理论依据。 

关键词：枯草芽孢杆菌; 益生菌剂; 稳定性

近年来，抗生素的滥用不仅破坏动物肠道平 衡，导致菌群失调，使动物免疫力下降，而且使致 病菌产生耐药性，导致动物内源性感染，最重要的 是在畜禽产品中抗生素的残留，直接威胁着人类的 健康，可见生产绿色畜产品愈显重要。世界上许多 国家己颁发在饲料中禁止或限制使用抗生素的法律 法规。因此，开发一种能够替代抗生素的绿色饲料 添加剂已经迫在眉睫。益生菌作为一类能够改善动 物胃肠道菌群平衡并促进动物健康生长的益生菌 剂，是一种活的饲料添加剂，具有不残留、无污 染、无毒及无不良反应等优点，能够维持肠道菌群 平衡、提高免疫力、促进消化、提高生长性能、抗 肿瘤、抑制或杀灭病原菌的生长及改善环境污染 等，这对促进养殖业的发展有重大意义。枯草芽孢 杆菌作为一种益生菌，是革兰阳性菌，杆菌、产芽 孢及好氧，具有耐酸碱、耐高温及耐挤压等特性， 能够颉颃病原菌，维持并调整肠道微生态平衡; 可 产生多种酶类，促进动物消化吸收; 促进动物生长 并改善动物生产性能; 增强免疫力，提高抗病能 力等。

研究枯草芽孢杆菌发酵罐扩大培养发酵工艺并 制备益生菌剂，通过检测枯草芽孢杆菌活菌制剂对 人工胃液、肠液及胆汁的耐受性，了解该益生菌剂 的性能，并研究其耐高温性和常温贮存的稳定性。 

1 材料与方法 

1.1 材料 

1.1.1 菌株 

  枯草芽孢杆菌 HEW － B110 由北京好实沃生物 技术有限公司提供。 

1.1.2 主要试剂 

   哈尔滨英瑞斯词料有限公司提供工业用废糖蜜 ［总糖含量达 57% ( 质量分数) ］、玉米粉和豆粕粉 ( 氮含量达 7. 63%) ; 国药提供葡萄糖、琼脂、酵 母提取物、七水硫酸镁、胰蛋白胨、磷酸二氢钾和 氯化钙等分析纯试剂。 

1.1.3 培养基及溶液 

   种子培养基: 胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%， NaCl 1%，pH 7. 0 ±0. 2，121 ℃灭菌20 min。 

   发酵培养基: 玉米粉 1%、糖蜜 1%、豆粕粉 0. 5%、KH2 PO4 0. 1% 和 CaCl2 0. 2%，121 ℃ 灭菌 20 min。 

   计数培养基: LB 琼脂培养基。 

   人工胃液: 稀盐酸16. 4 mL，加水约800 mL 与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释定容至1000 mL， pH 1. 5 左右，用孔径 0.22 μm 的微孔滤膜过滤除 菌，备用。 

  人工肠液: 磷酸二氢钾 6. 8 g，加水 500 mL， 用氢氧化钠溶液( 0. 1 mol/L) 调节 pH 至 6. 8，取胰 酶10 g，加适量水使其溶解，将 2 液混合后，加水 稀释定容至1 000 mL，用孔径0. 22 μm 的微孔滤膜 过滤除菌，备用。 

   0. 3%胆盐溶液: 取3 g 牛胆盐，加入适量蒸馏水 使其溶解，加水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min， 备用。 

1.1.4 仪器

   FLC －3CLEAN BENCH 超净工作台购自哈尔滨 市东联公司，LDZM 立式压力蒸汽灭菌器购自上海 申安医疗器械厂，HZQ － F160A 型恒温培养箱购自 上海一恒科学仪器有限公司，发酵罐购自上海世远 生物设备工程有限公司，SW － CJ － 2FD 型超净工 作台购于苏州净化设备有限公司，GQ105 管式离心 机购自黑龙江省哈尔滨乐能肽公司，水分测定仪购 自上海精科天美贸易有限公司等。 

1.2 试验方法 

1.2.1 枯草芽孢杆菌发酵培养 

1.2.1.1 菌种的活化及种子液制备 

   菌种活化: 将枯草芽孢杆菌甘油冻存管菌种在 LB 平板上进行划线分离，于 37 ℃倒置培养 24 h， 然后挑取单菌落于新鲜的斜面培养基上，37 ℃培养 20 h，4 ℃冰箱保藏备用。 

   种子液的制备: 取生长良好的斜面，分别加入 2 mL 灭菌氯化钠注射液，合并制成枯草芽孢杆菌菌 悬液，取1 mL 菌悬液于300 mL 种子培养基/1 000 mL 三角瓶中，37 ℃，200 r/min 培养18 h，得种子液。 

1.2.1.2 发酵扩大培养 

   利用50 L 发酵罐和发酵培养基进行扩大培养， 首先对发酵罐进行清洗，直至罐内清洁为止，并用 碱煮30 min 即进行空消，以 70% 的装液量，称量 发酵培养基各组分的量并投入发酵罐中，调节 pH 至6. 8 ±0. 2，并加入一定量的消泡剂，将进料口密 闭。将发酵罐内培养基进行灭菌，121 ℃灭菌30 min， 用自来水通过罐体夹层使其冷却或自然降温。待温 度降至37 ℃时接种，通过蠕动泵进行接种，封闭 接种口。设定发酵条件: 温度 37 ℃、pH 7. 0、接 种量3%及通气量为气液比2∶1，开始发酵，对发酵液每2 h 镜检并芽孢染色观察芽孢产生情况并检测 发酵液活菌数。 

1.2.1.3 发酵液中活菌数的测定 

   采用平板菌落计数法测定发酵液中活菌数。取 1 mL 发酵液，依次梯度稀释至10 －6和10 －7倍( 通过 预试验数据得出) ，将 0. 1 mL 的稀释液涂布于 LB 琼脂平板上( 至少做3 个重复)，37 ℃倒置培养24 h， 计数，计算发酵液中细菌总量。 

1.2.1.4 芽孢率的测定 

   当发酵液中活菌数不再增长，镜检视野内有大 量芽孢且基本无菌体或有少量存在，发酵结束，取 少量发酵液于 85 ℃水浴锅中水浴 15 min，立即用 冷水冷却至室温，然后通过平板菌落计数法测定活 菌数，即为芽孢数，计算芽孢率。 

1.2.1.5 发酵结束后静置对芽孢率的影响 

   将培养结束后的发酵液置于储存罐中，分别于 10、20、30、40、50 和60 h 后测其芽孢生成率。

1.2.2 枯草芽孢杆菌益生菌剂制备 

  取发酵完成后的发酵液，8 000 r/m 离心20 min， 去上清，收集枯草芽孢杆菌菌泥。在沉淀中再加入 沸石粉、玉米淀粉和葡萄糖等，混匀，50 ℃烘干后， 粉碎后过筛，测定枯草芽孢杆菌菌剂的活菌数及含 水量( 水分测定仪) ，分装密封后置于干燥处保存。 

1.2.3 枯草芽孢杆菌益生菌剂耐热性能的研究 

   取制备的益生菌剂 1 g 分别置于 85、95、105、 115 和125 ℃鼓风干燥箱中处理10 min，冷却，于 装有99 mL 灭菌氯化钠注射液的三角瓶中，200 r/min 震荡1 h，平板计数检测其活菌数。 

1.2.4 枯草芽孢杆菌益生菌剂在模拟胃肠道中的稳定性 

1.2.4.1 枯草芽孢杆菌益生菌剂对人工胃液的耐受性 

  取1 g 制备的益生菌剂接种于 99 mL 人工胃液 中，同时以无菌氯化钠注射液作为对照，置于37 ℃摇 床培养 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 和 3. 0 h 取样， 测其活菌数。 

1.2.4.2 枯草芽孢杆菌益生菌剂对人工肠液的耐受性 

   取1 g 制备的益生菌剂接种于 99 mL 人工肠液 中，同时以无菌氯化钠注射液作为对照，置于37 ℃摇 床培养 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 和 3. 0 h 取样， 测其活菌数。

1.2.4.3 枯草芽孢杆菌益生菌剂对胆盐的耐受性 

   取1 g 制备的益生菌剂接种于99 mL 0. 3%胆盐 溶液中，同时以无菌氯化钠主射液作为对照，置于 37 ℃摇床培养5 h，测其活菌数。 1.2.5 枯草芽孢杆菌益生菌剂贮存的稳定性 

   将密封保存的枯草芽孢杆菌制剂每月进行1 次 活菌数和含水量的检测。 

2 结果与分析 

2.1 枯草芽孢杆菌发酵罐发酵生长状况 

   枯草芽孢杆菌发酵罐发酵初期可见少量杆菌， 逐渐进入生长期可见大量杆菌，当发酵至 24 h 后， 开始产生芽孢，在稳定期产生大量芽孢，当发酵液 中活菌数不再增长，镜检视野内有大量芽孢且基本 无菌体或有少量存在，发酵结束，发酵液最终活菌 数达 24 亿 CFU/mL，芽孢数为 20 亿 CFU/mL，芽 孢率83. 33%。 2.2 发酵结束后静置对芽孢率的影响 芽孢的快速生产有可能会受到外界条件的刺 激，如突然降温、添加一些物质及静置等，都可大 大提高芽孢的形成率，根据试验经验发现，发酵后 的菌液在室温条件下静置1 ～2 d，发酵液表面会形 成议程褶皱的膜状物，通过镜检为芽孢，而且芽孢 量高达90%以上，因此试验研究发酵结束后静置时 间对枯草芽孢杆菌芽孢形成的影响，在发酵罐发酵 培养24 h 后，将发酵液静置，并在静置 10、20、 30、40、50 和60 h 后检测芽孢率，结果见表1。

表1 发酵结束后放置时间对枯草芽孢杆菌芽孢形成率的影响结果  

从表1 可见: 枯草芽孢杆菌的芽孢率随着放置 时间的延长而逐渐增加，在 50 h 后基本趋于稳定， 芽孢率可达96%，所以在工业生产中，发酵完成后 的菌液可以放置于室温条件下50 h，待大量形成芽 孢后，再进行后续处理。 

2.3 枯草芽孢杆菌益生菌剂耐热性能研究 

   试验制备的枯草芽孢杆菌益生菌剂的活性高达 1 000亿 CFU/g，含水量为 5%。从表 2 可见: 温度 在85 ～105 ℃时，枯草芽孢杆菌的存活率高达90% 以上，可见经处理包被后的枯草芽孢杆菌益生菌剂 具有较好的耐高温性能。在饲料生产中，高温制粒会对益生菌剂的活性有影响，研究结果表明: 该枯 草芽孢杆菌益生菌剂可抵御105 ℃高温。 

表2 不同温度对枯草芽孢杆菌益生菌剂存活率的影响 

2.4 枯草芽孢杆菌益生菌剂对人工胃液的耐受性 

   从表3 可见: 枯草芽孢杆菌益生菌剂在 pH 为 1. 5 的人工胃液中，活菌数从 1. 0 h 开始有所下降， 2. 5 h 时后下降幅度较大，因此，枯草芽孢杆菌益 生菌剂可耐受动物胃液并进入小肠发挥作用。 

表3 枯草芽孢杆菌益生菌剂对人工胃液的耐受性 亿 CFU/g 

2.5 枯草芽孢杆菌益生菌剂对人工肠液的耐受性 

   从表4 可见: 枯草芽孢杆菌益生菌剂在人工肠 液中经不同时间后，活菌数没有降低，反而有所增 加，可见人工肠液对枯草芽孢杆菌益生菌剂存活率 没有负面影响，表明该益生菌剂可耐受人工肠液。 

表4 枯草芽孢杆菌益生菌剂对人工肠液的耐受性 亿 CFU/g 

2.6 枯草芽孢杆菌益生菌剂对胆盐的耐受性 

   该益生菌剂对胆汁溶液的耐受性较好，在 0. 3%胆酸盐溶液中有78 亿 CFU/g 活菌存活，小肠 液中胆汁的作用主要是由胆酸盐来实现，一般在 0. 03% ～0. 3% 波动，进食后胆汁的分泌另开始增 加，分泌的胆汁主要贮存于胆囊中。研究中枯草芽 孢杆菌益生菌剂在含有胆酸盐的溶液中作用时间为 5 h，所以枯草芽孢杆菌能够在肠道内耐受胆汁分泌 质量浓度的压力。 

2.7 枯草芽孢杆菌益生菌剂贮存稳定性研究 

   枯草芽孢杆菌益生菌剂每月测一次活菌和含水 量，共检测12 个月，结果见表5。该益生菌剂稳定 性良好，保存 12 个月后，活性基本没有衰减，表 明该益生菌剂可在室温条件保存，且稳定性良好。 

表5 枯草芽孢杆菌益生菌剂活菌衰减情况表 

3 结论 

   芽孢一般是在芽孢细菌生长后期细胞内形成的 抗逆休眠体，能够耐热、抗辐射、耐酸碱及抗化学 药物等，因此枯草芽孢杆菌益生菌剂具有耐热、耐 酸、耐胆盐并能后长期保存等优点。研究通过发酵罐发酵，保证高活菌数并提高芽孢 率，使芽孢率达到96%。微生态制剂面临的主要问题是不能耐受制粒过 程中的高温环境和动物的胃肠道溶液的低 pH 及一 些消化酶的作用。研究通过试验证实，枯草芽孢杆 菌益生菌剂具有较高的芽孢率，并且能够耐 105 ℃ 高温10 min，且能够耐受正常动物胃肠道的胃液、 肠液和胆汁。此外，枯草芽孢杆菌益生菌剂保存过 程中活菌数的基本不会下降。

 

参考文献

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