鸡源乳酸菌的分离鉴定

杜志琳  李雪平  尹望

（北京好实沃生物技术有限公司，北京101399）

摘  要：在本研究中，采用MRS培养基从健康AA肉鸡十二指肠、空肠、回肠及盲肠中分离获得11株乳酸菌，并对其进行形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列同源性分析，最终确定所分离的菌株主要是5种乳酸杆菌（嗜酸乳杆菌R1、植物乳杆菌R2、鼠李糖乳杆菌R3、短乳杆菌R4、发酵乳杆菌R5）、4种肠球菌（盲肠肠球菌R9、粪肠球菌R8、R10、鸟肠球菌R7、屎肠球菌R6、R11）。

关键词：鸡源，乳酸菌，分离鉴定

畜禽养殖中抗生素的过度添加给人类和畜禽养殖带来了负面影响，如药物残留、超级细菌、环境污染、耐药性等问题，而人们对健康畜牧业和绿色食品也越来越关注，因此寻求一种有机无公害的饲料添加剂势在必行^[1~4]。微生态制剂作为一种绿色添加剂出现，因其天然、无残留、无毒害安全可靠倍受关注，可直接进入动物肠道中，定植在动物肠道中，抑制外来病原菌的入侵，维持动物肠道平衡，促进动物对营养物质的吸收，增强免疫等^[5]，包括乳酸菌、芽孢杆菌、酵母及霉菌等，其中乳酸菌是动物肠道中的正常菌群之一，具有较强的粘附力，可定植在肠粘膜上，形成乳酸菌屏障^[6~8]。乳酸菌有益于肠道内正常菌群生长，并能减少大肠杆菌和沙门菌等病原菌在肠道内的定植，从而达到清除肠道腐败菌及改善宿主胃肠道功能的作用，维护动物健康。因此，从动物肠道中分离获得的乳酸菌对肠道环境有较高的适应性，更易于在肠道中定植。来自同种动物肠道的乳酸菌更有利于发挥益生功能^[9]。本试验健康AA肉鸡肠道中分离肠道乳酸菌，为禽用微生态制剂菌种的研发应用奠定基础。

1 材料

1.1 试验动物

试验选用30日龄健康AA肉鸡购自某散养户。

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基、MRS培养基、MRS+碳酸钙培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉水解培养基、糖醇发酵培养基、明胶液化培养基、VP试验培养基等生理生化培养基。

1.3 乳酸菌的分离

1.3.1 样品获得

   无菌采集AA健康肉鸡的十二指肠、空肠、回肠及盲肠的肠道内容物分别置于于无菌离心管中，并加入10倍灭菌生理盐水，混匀，稀释至10^-3倍。

1.3.2乳酸菌分离纯化

   取不同部位的稀释液100μL分别于MRS培养基及MRS+碳酸钙培养基上涂布均匀，每个部位至少三个重复，37℃倒置培养24h-48h。挑取形态不同的菌落在MRS培养基上划线培养24h-48h，并于斜面上保藏备用。

1.4 乳酸菌鉴定

1.4.1形态鉴定及染色观察

   观察MRS上菌落形态，并将纯化后获得的菌株进行革兰氏染色，通过油镜观察菌株的显微形态。

1.4.2生理生化鉴定

参照《常用细菌系统鉴定手册》^[9]将分离获得的菌株进行各种糖发酵、接触酶、硝酸盐还原、明胶液化等试验，初步鉴定其种类。

1.4.3分子生物学鉴定

  通过试剂盒提取分离获得的菌株基因组DNA。50μL PCR扩增体系包括引物F和R各2.0μL，Taq DNA聚合酶3U，10×Taq buffer5μL，Mg²⁺ (25mmoL/L)3μL，菌株基因组DNA2μL，加双蒸水至50μL。反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃温浴10min，4℃保持。反应结束后PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果，回收所得PCR产物，送生物工程（上海）有限公司进行DNA序列的测定，序列经BLAST比对初步鉴定种属，通过Mega软件构建系统发育进化树。

3 结果与分析

3.1形态特征及染色结果

11株乳酸菌疑似菌（命名为R1、R2、……、R11），菌落均呈白色，隆起，表面湿润且光滑，有光泽，边缘整齐。在含有碳酸钙的MRS培养基上菌落周围有透明荣钙圈。革兰氏染色均为阳性，球状或杆状，单个、成对或成链状排列，无芽孢。R1~Ｒ5为杆菌，R6~R11为球菌。

3.2生理生化鉴定

11株疑似乳酸菌的生理生化试验结果如表1所示，参照《常见细菌系统鉴定手册》可初步鉴定R1~Ｒ5为乳酸杆菌，R6~R11为肠球菌。

表1 疑似乳酸菌生理生化试验结果

             注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性

3.3分子鉴定结果

11株疑似菌株的16SrDNA PCR扩增产物大小均在1300~1500bp之间，琼脂糖凝胶电泳如图1所示。并将11株疑似菌株的16SrDNA序列进行BLAST同源性分析，发现R1与嗜酸乳杆菌序列同源性为99.7%，R2与植物乳杆菌序列同源性为99.6%，R3与鼠李糖乳杆菌序列同源性为99.5%，R4与短乳杆菌序列同源性为99.8%，R5与发酵乳杆菌序列同源性为99.7%，R6和R11与屎肠球菌序列同源性为99.6%，R7与鸟肠球菌序列同源性为99.8%，R8和R10与粪肠球菌序列同源性为99.6%，R9与盲肠肠球菌序列同源性为99.9%。

系统发育进化树如图2，R1与嗜酸乳杆菌EU878007位于同一支，R2与植物乳杆菌NR_115605位于同一支，R3与鼠李糖乳杆菌EF495247位于同一支，R4与短乳杆菌NR_044704位于同一支，R5与发酵乳杆菌FJ462686位于同一支，R6和R11与屎肠球菌KM186186位于同一支，R7与鸟肠球菌KR363182位于同一支，R8和R10与粪肠球菌EU887827位于同一支，R9与盲肠肠球菌NR_119291位于同一支。

注：M为DL2000 ladder 条带由上之下分别为2000bp、100bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图1 11株分离菌的16SrDNA PCR扩增结果

图2 11株分离菌的遗传系统发育进化树

4 讨论

   乳酸菌制剂是一种新型微生态制剂，已经引起人们的关注，但是乳酸菌的应用效果不同，这主要与乳酸菌菌株的来源有关^[11]。目前已有许多乳酸菌菌株是通过体外环境筛选获得的，与体内环境差异较大，来源于外界环境的乳酸菌不能耐受低pH和胆汁，且不易定植在肠壁上。许多研究者认为，理想的益生菌最好来自动物肠道^[12]。因此本研究从健康肉鸡肠道的不同肠段分离乳酸菌，主要是基于肠道内乳酸菌的作用环境考虑，肠道中的有益菌已经经历过低pH的酸性环境和胆汁的影响，相对于其他部位的微生物而言，其耐酸性和耐胆盐性能较强。

   多年来，人们鉴定乳酸菌主要采用常规鉴定方法^[13]，本研究采用了常规鉴定和16SrDNA两者结合的方法，从健康AA肉鸡肠道不同肠段中分离乳酸菌，通过对疑似菌株的形态观察、染色后显微形态观察、生理生化试验16SrDNA基因片段以及系统发育进化树分析，最终确定从健康AA肉鸡肠道中分离得到的11株益生菌，即5种乳酸杆菌（嗜酸乳杆菌R1、植物乳杆菌R2、鼠李糖乳杆菌R3、短乳杆菌R4、发酵乳杆菌R5）、4种肠球菌（盲肠肠球菌R9、粪肠球菌R8、R10、鸟肠球菌R7、屎肠球菌R6、R11）。

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