一株抗逆性芽孢杆菌的分离鉴定
一株抗逆性芽孢杆菌的分离鉴定
汤立
北京好实沃生物技术有限公司，北京101399
摘 要：本试验通过对健康鸡肠道内容物高温处理后，筛选获得5株芽孢杆菌，并进行耐酸试验、耐胆盐试验及抑菌试验，最终获得一株抗逆性最强的菌株HEW-Y4，并对其进行形态观察、生理生化试验及16SrDNA序列同源性分析，最终确定其为地衣芽孢杆菌。
关键词：抗逆性，芽孢杆菌，分离鉴定
近年来，人们对绿色安全畜禽产品的呼唤，以及对自身健康、绿色环境的重视，政府部门也加大了饲料生产及绿色养殖的监督力度，已全面实施绿色畜禽养殖的工程[1]。动物微生态制剂在畜牧业中应用非常广泛，研究报道较多，并表现出良好的效果，应用遍及单胃动物、反刍动物及水产动物等。动物微生态制剂的种类也越来越多，包括乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母和曲霉等，乳酸杆菌及其他菌均不奶搜饲料加工的高温及长期存放，而芽孢杆菌则可在不利条件下产生芽孢，可耐受饲料加工的高温环境、耐储藏及耐胃酸等仍保持较高的活性，并能在肠道中萌发，为宿主提供营养物质、促进动物生长以及提高饲料转化率[2，3]。
本研究从健康鸡肠道中分离获得5株芽孢杆菌，并对其进行抗逆性筛选，最终获得抗逆性较强的芽孢杆菌，然后对其生理生化特性及16SrDNA鉴定，为芽孢杆菌的研究奠定基础，并丰富了动物微生态制剂的菌种。
1 材料与方法
-
- 试验动物
试验选用健康肉鸡购自某养殖场。
1.2 培养基
牛肉膏蛋白胨（NA）培养基、淀粉水解培养基、纤维素水解培养基、耐盐培养基、糖醇发酵培养基、明胶液化培养基、丙酸盐培养基、VP试验培养基等生理生化培养基。
1.3 芽孢杆菌的分离
1.3.1 样品获得
无菌采集健康肉鸡的肠道内容物置于无菌离心管中，并加入10倍灭菌生理盐水，混匀，稀释至10-3倍。
1.3.2 芽孢杆菌分离纯化
从健康鸡肠道获得其肠道，置于灭菌塑封袋中，在无菌条件下取肠道内容物1g于9mL灭菌生理盐水中，混匀并于85℃水浴锅水浴15min，再进行十倍梯度稀释，并取合适的稀释液100μL分别于NA培养基上涂布均匀，至少三个重复，37℃倒置培养24h-48h。挑取形态不同的菌落在NA培养基上划线纯化培养24h-48h，至少纯化三次，并进行斜面活化，4℃保藏备用。
1.4 抗逆性芽孢杆菌筛选鉴定
1.4.1 耐酸试验
将获得的菌株分别接种于pH分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和7.0（未加盐酸）的NA培养基中，充分混匀后，静置培养3h，进行计数，至少三个重复，并计算芽孢杆菌的存活率。
1.4.2 耐胆盐试验
将获得的菌株分别接种于胆盐浓度分别为0%（空白对照）、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%和0.4%的NA培养基中，充分混匀后，静置培养3h，进行计数，至少三个重复，并计算芽孢杆菌的存活率。
1.4.3 抑菌试验
分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌进行液体培养，并稀释使其浓度为10-7cfu/mL，涂布在NA平板上备用，将获得的菌株同样进行液体培养后，离心去菌体，获得上清液备用。将含有病原菌的NA平板上分别放置牛津杯，然后将每个牛津杯中分别加入获得菌株的液体发酵液200μL。于37℃恒温培养箱中培养24-48h，观察试验结果，至少做三个重复。
1.5 芽孢杆菌鉴定
1.5.1 形态鉴定及染色观察
观察NA平板上菌落形态，并将纯化后获得的菌株进行革兰氏染色，并观察菌株的显微形态。
1.5.2 生理生化鉴定
参照《常用细菌系统鉴定手册》[4]将分离获得的菌株进行各种糖发酵、接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、丙酸盐、明胶液化等试验，初步鉴定其种类。
1.5.3 16SrDNA鉴定
通过DNA提取试剂盒提取获得菌株的基因组DNA，并进行PCR扩增，PCR产物进行电泳检测，回收所得PCR产物，进行测序，序列经BLAST比对初步鉴定种属，进行系统发育分析。
2 结果与分析
2.1 抗逆性试验结果
从鸡肠道内容物中分离获得5株芽孢杆菌（命名为HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4、HEW-Y5），进行耐酸性、耐胆盐及抑菌试验。5株芽孢杆菌在不同pH溶液中存活率如表1所示，结果显示，菌株HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4及HEW-Y5能耐受pH1.5~4.0的酸性环境，且菌株HEW-Y4的耐酸性能最强，其在pH1.5溶液3h，存活率达到70.47%，HEW-Y1和HEW-Y5存活率在60%以上，分别为63.25%、61.27%，HEW-Y2 和HEW-Y3存活率分别为42.98%、37.52%，表明这五株菌均能耐受体外强酸环境。
表1 获得的菌株在不同pH溶液中的存活率
|
pH |
1.5 |
2.0 |
3.0 |
3.5 |
4.0 |
7.0 |
|
HEW-Y1 |
63.25% |
65.42% |
70.79% |
80.26% |
85.18% |
99.24% |
|
HEW-Y2 |
42.98% |
54.96% |
63.77% |
69.38% |
83.44% |
99.35% |
|
HEW-Y3 |
37.52% |
47.62% |
58.82% |
71.77% |
80.37% |
99.18% |
|
HEW-Y4 |
70.47% |
78.48% |
80.16% |
87.45% |
90.82% |
99.97% |
|
HEW-Y5 |
61.27% |
65.89% |
78.35% |
82.17% |
87.63% |
99.42% |
5株芽孢杆菌在不同胆盐浓度的溶液种存活率如表2所示，可知这几株菌随着胆盐浓度的增加，它们的存活率均有不同程度降低，当胆盐浓度达到0.3%时，作用2h，HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4、HEW-Y5存活率分别为75.72%、78.25%、76.24%、86.73%、82.52%，表明这几株菌均对胆盐较强耐受力，均能够体外模拟的高胆盐环境，其中菌株HEW-Y4的耐胆盐性能最强。
表2 获得的菌株在不同胆盐浓度溶液中的存活率
|
胆盐浓度 |
HEW-Y1 |
HEW-Y2 |
HEW-Y3 |
HEW-Y4 |
HEW-Y5 |
|
0% |
100% |
100% |
100% |
100% |
100% |
|
0.05% |
87.34% |
95.45% |
89.45% |
98.36% |
94.24% |
|
0.1% |
85.78% |
92.11% |
88.54% |
96.79% |
92.28% |
|
0.15% |
81.89% |
87.44% |
87.26% |
92.88% |
88.76% |
|
0.2% |
778.74% |
85.47% |
85.96% |
89.75% |
85.34% |
|
0.25% |
77.63% |
83.55% |
79.52% |
88.64% |
84.53% |
|
0.3% |
75.72% |
78.25% |
76.24% |
86.73% |
82.52% |
|
0.35% |
72.67% |
76.14% |
75.39% |
83.68% |
79.37% |
|
0.4% |
70.94% |
74.22% |
71.72% |
81.95% |
77.74% |
菌株HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4及HEW-Y5对病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌试验表明，这五株菌菌对大肠杆菌有较强的抑制作用，菌株HEW-Y1、HEW-Y3及HEW-Y4对金黄色葡萄球菌有抑菌效果，菌株HEW-Y2、HEW-Y4、HEW-Y5对沙门氏菌有抑菌效果，表明菌株 HEW-Y4对病原菌的抑制效果最佳。
综合菌株HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4及HEW-Y5的耐酸试验、耐胆盐试验及抑菌试验考虑，发现菌株HEW-Y4能够耐受体外模拟酸环境和高胆盐环境，且抑菌性能最佳，因此将菌株HEW-Y4确认为一株抗逆性较强的菌株，为下一步研究做准备。
2.2 形态特征及染色结果
菌株HEW-Y4菌落形态及显微形态如图1所示。在NA平板上菌落菌落呈圆形不透明，表面干燥且粗糙，边缘薄，不易挑起，革兰氏染色为阳性，杆状，单个或成对排列，产芽孢。
图1 菌株HEW-Y4菌落形态及显微形态图
2.2生理生化鉴定
菌株HEW-Y4的部分生理生化试验结果如表3所示，HEW-Y4能够利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖等，液化明胶，水解淀粉和酪氨酸，V-P试验和过氧化氢酶试验为阳性等。参照《常见细菌系统鉴定手册》可初步鉴定HEW-Y4为地衣芽孢杆菌
表3 HEW-Y4部分生理生化试验结果
|
菌株 |
HEW-Y4 |
菌株 |
HEW-Y4 |
|
葡萄糖 |
＋ |
棉籽糖 |
- |
|
半乳糖 |
＋ |
甘露醇 |
＋ |
|
果糖 |
＋ |
酪氨酸水解 |
＋ |
|
乳糖 |
＋ |
淀粉水解 |
＋ |
|
蔗糖 |
＋ |
明胶液化 |
＋ |
|
麦芽糖 |
＋ |
V-P试验 |
＋ |
|
木糖 |
＋ |
厌氧生长 |
＋ |
|
阿拉伯糖 |
＋ |
过氧化氢酶 |
＋ |
|
山梨醇 |
＋ |
柠檬酸盐 |
＋ |
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性
2.3 分子鉴定结果
菌株HEW-Y4的16SrDNA PCR扩增产物大小为1462bp，琼脂糖凝胶电泳如图2所示。菌株HEW-Y4的16SrDNA序列进行BLAST比对，发现HEW-Y4与地衣芽孢杆菌序列同源性为99.8%，结合生态学特征及生理生化试验结果考虑，鉴定HEW-Y4为地衣芽孢杆菌。
图2 菌株HEW-Y4的琼脂凝胶电泳图
3 讨论
微生态制剂可有效调整肠道微生态平衡、促进动物生长、降低料肉比及死亡率、提高宿主免疫力等功效。但在实际应用中，微生态制剂的效果不稳定，除了与宿主动物的年龄、生理状态有关外，菌种本身的特性也是关键[5]。微生态制剂添加在饲料中，随着饲料一起进入动物体内，先到达胃部，胃液是一个含有胃蛋白酶的酸性环境中，再到达机体最重要的吸收器官小肠，肠液中含有胰蛋白酶、胰脂肪酶等各种酶及胆盐等，益生菌必须要想发挥作用，必须能够在胃肠道中存活，并达到一定数量。所以，益生菌必须能够耐受胃酸液、肠液及胆盐等，才能有效地发挥作用。芽孢杆菌能够形成抗逆性强的芽孢休眠提，可以在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的芽孢休眠体，可耐受各种不利条件[6,7]。本研究通过热处理健康鸡肠道内容物，获得五株杆菌，并通过耐酸试验、耐胆盐试验及抑菌试验，复筛获得一株抗逆性强的芽孢杆菌HEW-Y4，其在pH为1.5的酸溶液中处理3h，存活率为70.47%，0.4%胆盐溶液存活率为81.95%。
传统的鉴定方法一般是通过形态学和生理生化鉴定，来粗略鉴定，其耗时较长，容易受干扰且产生误差[8]。近年来，基于生物技术的快速发展，微生态的鉴定方法也发生了日新月异的变化，16SrRNA携带充分的生物信息，能够用于系统进化分析，通过进行比对16SrRNA序列来确定微生物的分类地位，其简单方便且准确性高[7]。本研究通过对菌株HEW-Y4菌落形态观察、镜检、生理生化试验、16SrDNA序列分析以及同源性分析，最终确定菌株HEW-Y4为地衣芽孢杆菌。
参考文献
- 赵文龙,王龙,张永红,等.一株抗逆性凝结芽孢杆菌的分离与鉴定[J].北京农学院学报,2014,29(2):36-39.
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- 海洋,赵玉军,陈晓月,等.鸡肠道芽胞杆菌的分离鉴定及产蛋白菌株的筛选试验[J].浙江畜牧兽医,2008,33(6):5-6.
- 东秀珠,蔡妙英,等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.
- 许云贺,曹新民,张莉力,等.枯草芽孢杆菌HY4体外益生性能的研究[J].饲料研究,2014,(5):4-6.
- 唐建中,戴求仲,周旺平.高温处理及试验制粒对两种有益芽孢杆菌的影响[J].饲料博览,2009,(4):25-27.
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