添加不同水平黑曲霉对奶牛瘤胃体外发酵参数、甲烷排放及微生物区系的影响

 

摘要：【目的】试验旨在研究黑曲霉(Aspergillus niger)对奶牛瘤胃体外发酵、甲烷(CH4)排放及微生物区系的影响，为黑曲霉作为饲料添加剂在奶牛生产中的合理应用提供理论依据。【方法】采用体外瘤胃发酵装置，共分为4组：A(对照组)、B、C和D组，分别向每组发酵瓶(含人工饲料及培养液)中添加0、15、20、25mg黑曲霉(孢子浓度≥1.0×109/g)；每种处理设3次重复，另设3个空白组以校正气体和CH4产量(空白组不含饲料，只有培养液)；在培养开始后的第3、6、9、12、24h，测量产气量和CH4产量；培养24h后，分析发酵液的pH、氨态氮(NH₃-N)、微生物蛋白(MCP)、挥发性脂肪酸(VFA)以及瘤胃微生物群落多样性。【结果】与A组相比，B、C和D组的体外瘤胃发酵液pH显著升高(P<0.05)，NH₃-N含量显著降低(P<0.05)，且C和D组的MCP含量显著高于A组(P<0.05)，而B组则显著低于其他3组(P<0.05)。各组之间各种VFA含量、乙酸/丙酸比值以及总挥发性脂肪酸(TVFA)含量均无显著差异(P>0.05)。A组CH4产量占总产气量比值显著高于B、C和D组(P<0.05)。16SrRNA测序表明，与A组相比，B组瘤胃微生物Alpha及Beta多样性指数无显著差异(P>0.05)。在瘤胃门水平前10种细菌中，其中变形菌门和拟杆菌门为奶牛瘤胃中的优势菌门，且A、B两组差异不显著(P>0.05)；螺旋体菌门与丙酸和NH3-N含量呈显著负相关(P<0.05)；纤维杆菌门与pH呈显著正相关(P<0.05)，与戊酸、丁酸、乙酸、CH4，和NH3-N含量呈显著负相关(P<0.05)。在瘤胃属水平前10种细菌中，其中普氏菌属和理研菌科RC9为奶牛瘤胃中的优势菌属；与A组相比，B组琥珀酸弧菌属的相对丰度显著降低(P<0.05)。理研菌科RC9与NH3-N含量呈显著正相关(P<0.05)；拟杆菌目RF16细菌属与戊酸、丁酸、乙酸、CH4和NH₃-N含量呈显著正相关(P<0.05)。与A组相比，B组细菌和产甲烷菌的绝对含量显著增加(P<0.05)；B组原虫的绝对含量显著减少(P<0.05)。【结论】黑曲霉的添加在改善奶牛瘤胃发酵环境的同时，通过调节瘤胃内微生物群落结构，影响VFA、NH3-N、MCP的产生和CH4的排放，研究结果揭示了微生物干预措施对提升奶牛健康和生产效率潜在的复杂作用机制。

关键词：黑曲霉；瘤胃体外发酵；甲烷排放；微生物区系

近年来，农业活动尤其是反刍动物的甲烷(CH4)排放对温室效应的影响成为了人们关注的焦点。据估计，全球农业温室气体排放中，CH4占有相当大的比例，而反刍动物如奶牛和绵羊是主要的CH4排放源。这些CH4排放不仅加剧了温室效应，还对生态系统平衡和公共健康构成威胁。黑曲霉(Aspergillus niger)是一种兼性厌氧生物，可以在有氧和微氧环境下生长，具有强大的代谢能力，能够降解并利用各类有机物质作为碳和能量来源，包括糖类、酸类、醇类以及多种多糖和纤维素。黑曲霉在发酵工业中有着悠久的安全使用历史，在反刍动物生产中的应用主要集中于其作为饲料添加剂的使用。黑曲霉对反刍动物瘤胃内环境的影响主要体现在其对瘤胃发酵过程的调节能力上，特别是通过改善瘤胃内的微生物组成、增强营养成分的吸收和消化。研究发现，黑曲霉能够产生大量的纤维素酶、半纤维素酶等，这些酶有助于瘤胃内难以消化纤维的分解，提高瘤胃的发酵效率，进而提高反刍动物对营养物质的消化吸收率。黑曲霉发酵的培养物可以显著提高发酵饲料中粗蛋白质含量，降低粗纤维含量，并且其作为添加剂能提高育肥期哈萨克羊的营养表观消化率及稳定瘤胃pH。有研究表明，添加黑曲霉的代谢产物β-1，4-木聚糖酶XYL10C到小麦秸秆颗粒中，能够改变瘤胃微生物组成，且不影响羔羊的生长性能。此外，在黑曲霉提取的多糖单加氧酶(AnLPMO)对于水稻秸秆体外瘤胃微生物发酵的影响中，AnLPMO的添加可显著提高水稻秸秆干物质的体外消化率并刺激瘤胃细菌类群的生长，从而促进纤维降解。尽管直接关于黑曲霉降低CH4排放的研究相对有限，但一些研究表明，通过改善瘤胃发酵效率和调节微生物组成可以间接降低CH4产生。因此，探索黑曲霉作为饲料添加剂对奶牛瘤胃体外发酵参数，减少CH4排放和微生物区系方面的影响，对于推动农业生产的可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌种

黑曲霉(孢子浓度≥1.0×109/g)，购自济宁玉园生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂及仪器

氯化铵、次氯酸钠、NaCl、NaOH、磷酸、水杨酸钠、浓盐酸、亚硝基铁氰化钠均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考马斯亮蓝、牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司；95%乙醇购自济南振达化工有限公司；丙酸(PA)购自上海安谱实验科技股份有限公司；异丁酸(IBA)、异戊酸(IVA)购自广州硕谱生物科技有限公司；丁酸(BA)购自上海希格玛生物科技有限公司；乙酸(AA)、戊酸(VA)、甲基叔丁基醚购自上海乾思生物科技有限公司；正己酸购自上海易恩化学技术有限公司；D4-乙酸购自南京昊绿生物科技有限公司；磷酸购自上海沪试分析仪器有限公司；移液枪、台式小型离心机、台式高速冷冻离心机购自Eppendorf公司；酶标仪购自Billerica公司；pH计购自Mettler Toledo公司；气相色谱质谱联用仪购自Agilent公司；球磨仪购自RetsCH4公司；多管涡旋振荡器购自上海净信实业发展有限公司；超声清洗仪购自昆山舒美超声仪器有限公司。

1.2 试验设计

试验采用体外瘤胃发酵装置，共分为4组：A(对照组)、B、C和D组(试验组)，分别向每组发酵瓶(含人工饲料及培养液)添加0、15(孢子总数≥1.5×107)、20(孢子总数≥2.0×107)和25mg(孢子总数≥2.5×107)黑曲霉；每种处理设3次重复，另设3个空白组用以校正产气量和CH4产量(空白组仅为人工瘤胃培养液，无人工饲料)。在培养开始后的第 3、6、9、12、24h，测量产气量和CH4产量。24h停止发酵后，测定发酵液的pH、氨态氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸以及瘤胃微生物群落多样性。

1.3 体外瘤胃发酵培养

试验所用的人工饲料为粉碎、过40目筛的玉米粉和花生秧粉，其营养成分见表1。将两种人工饲料按1：1比例进行充分混合均匀，待用。

表1人工饲料的营养成分(干物质基础)

营养水平均为实测值

人工唾液共包括5种溶液，具体构成见表2。人工唾液中这5种溶液的配比见表3。试验当天，将配制完成的人工唾液39℃水浴，并持续通入CO2，直到溶液由淡蓝色转为无色，即刻使用。

表2人工唾液中5种溶液的构成

表3 人工唾液配比

本试验使用的瘤胃液采自两头荷斯坦奶牛，试验当日晨饲前采集新鲜瘤胃液，立即置于充满CO2的瓶中，并用39℃保温箱运至实验室；在厌氧箱中使用4层纱布过滤；试验过程中，每个培养瓶内先加人2g人工饲料，注入150mL.人工瘤胃培养基(包括50mL.瘤胃液与100mI.人工唾液)，充满CO2后迅速封口以保持厌氧状态；培养瓶置于39℃恒温箱中进行发酵培养。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 总产气量和CH4产量测定

在培养的第3、6、9、12和24h，分别取出培养瓶；将气压表插入培养瓶中，记录气压表读数；注射器抽取发酵气体，注入集气袋。为测定CH4含量，每次测量前轻晃培养瓶以保证CH4分布均匀。使用气相色谱仪测量标准曲线，得到CH4气体浓度与峰面积之间的关系。通过外标法，将测得的标样浓度(20.1mg/m3)和其对应的峰面积作为标准曲线的数据点。收集产气样品并用气相色谱仪测量，得到峰面积PCH4t将峰面积PCH4t带人公式：

VCH4t=(Vgast+70)×PCH4t/1000000

V＇CH4t =VCH4t/Vgast×100%

其中，PCH4t (mg/m3)为各处理组发酵t小时峰面积；VCH4t (mL)为各处理组发酵t小时CH4产量；Vgast(mL.)为各处理组发酵t小时的净产气量；V＇CH4t (%)为各处理组发酵t小时CH4浓度。

1.4.2 瘤胃发酵参数测定

培养液发酵24h后，迅速用冰水混合物冷凝发酵液后，将pH探头插入培养液中，待度数稳定后记录数值。NH3-N采用比色法分析测定；挥发性脂肪酸(VFA)参照许斌斌的方法测定；MCP采用考马斯亮蓝法分析测定，MCP计算为原虫蛋白加细菌蛋白之和。

1.4.3 瘤胃微生物区系分析

经过对比，发现A组和B组在CH4排放以及其他关键指标上呈现出明显的差异。为了深入探索这些差异的原因，从A组和B组各选择3个重复样本，进行16S rRNA基因测序。采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒从瘤胃液样本中提取DNA。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，以引物序列(338F：5＇-ACTCCTACGGGAGGCA-GCAG-3＇；806R：5＇-GG-ACTACH4VGGGTWTCTAAT-3＇)对细菌16S rRNA V3 +V4区域进行PCR扩增；由Illumina NovaSeq测序平台根据序列质量进行初步筛查，对问题样本进行重测、补测；通过质量初筛的原始序列按照index和barcode信息，进行文库和样本划分，并去除barcode序列；按照DADA2分析流程进行序列去噪得到分类操作单元(OTU)代表序列，采用RDP分类器算法对OTU代表序列进行分类，获得物种分类学注释及门、属水平的物种组成分析；使用QIIME2(v1.8.0)软件进行Alpha多样性分析；用Silval数据库对OTU代表性序列进行Beta多样性分析，并采用Abund-Jaccard近似距离算法计算每个样本的菌群相似度，在OTU水平进行主坐标分析(PCoA)。

1.4.4 瘤胃微生物的实时荧光定量PCR分析

为了从微生物层面探究黑曲霉对CH4的影响，从A组和B组各选择3个重复样本，采用实时荧光定量PCR绝对定量法检测样本中细菌(16S rRNA 基因)、产甲烷菌(甲基辅酶M还原酶(mcrA)基因)、原虫(18S rRNA基因)的绝对含量，其引物序列见表4。样品送上海美吉生物医药科技有限公司完成定量检测，并根据标准曲线计算样品目的基因的绝对拷贝数。

表4 引物序列

1.4.5 数据统计分析

试验数据采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan氏法多重比较。采用OriginPro2021软件对瘤胃门、属水平微生物相对丰度与CH4产量、产气量和瘤胃发酵参数之间进行相关性分析。结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示显著差异。

2 结果

2.1 黑曲霉对瘤胃pH、NH3-N，MCP和VFA含量的影响

由表5可见，与A组相比，B.C和D组的体外瘤胃发酵液pH显著升高(P<0.05)，NH3-N含量显著降低(P<0.05)；C和D组的MCP含量显著高于A组(P<0.05)，而B组则显著低于其他3组(P<0.05)。各组之间各种VFA含量、乙酸/丙酸比值以及总挥发性脂肪酸(TVFA)含量均未显示出显著差异(P>0.05)。

表5黑曲霉对瘤胃发酵参数的影响

同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 黑曲霉对产气量和CH4产量的影响

由表6可以看出，在24h的发酵培养后，A、C、D组间体外瘤胃发酵液的总产气量差异均不显著(P>0.05)，均显著高于B组(P<0.05)。与A组相比，B、C组体外瘤胃发酵液的CH4产量均显著下降(P<0.05)，而D组差异不显著(P>0.05)。B、C和D组CH4产量占总产气量比值显著低于A组(P<0.05)。

表6黑曲霉对瘤胃体外发酵24h的总产气量和总CH4产量的影响

2.3 黑曲霉对瘤胃微生物多样性的影响

2.3.1 瘤胃微生物Alpha多样性分析

经过对比，发现A组和B组在CH4排放以及其他关键指标上呈现出明显的差异。为了深入探索这些差异的原因，从A组和B组各选择了3个重复样本进行了16S rRNA基因测序。由表7可知，A、B 2组体外瘤胃发酵液中瘤胃微生物在细菌种群的覆盖率均在94%以上，Ace指数、CH4aol指数、Shannon指数、Simpson指数和Sobs指数在各组间均无显著性差异(P>0.05)。

表7瘤胃细菌丰富度和多样性分析

2.3.2 瘤胃微生物Beta多样性分析

对A和B组瘤胃液样本进行了主坐标分析(PCoA)，发现B组与A组瘤胃微生物基于abund_jaccard近似距离的PCoA无显著分离(P>0.05)(图1)。

2.3.3 瘤胃微生物OTUs分布根据各组

OTUs的韦恩图分析(图2)，可以得知A组的总OTUs数为2604，B组的总OTUs数为2650；A组和B组共有的OTUs数为1988，A组独有的OTUs数为616，B组独有的OTUs数为662；共有的OTUs数在A组和B组的总OTUs数中的占比分别为约76.3%和75.0%。

2.3.4 瘤胃微生物的组成和相对丰度

如表8所示，A、B两组瘤胃液中在门水平上的主要微生物菌群有厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体菌门、放线菌门、纤维杆菌门、变形菌门、疣微菌门、髌骨菌门、热脱硫杆菌门、蓝藻菌门等10种菌门，占据整个菌落的99%以上，其中变形菌门和拟杆菌门为瘤胃中的优势菌门；且A、B两组瘤胃微生物在门水平上差异均不显著(P>0.05)。

表8瘤胃细菌门水平菌群结构

如表9所示，A、B两组瘤胃液中在属水平上的主要微生物菌群有普氏菌属、理研菌科RC9、琥珀酸弧菌科UCG-002菌属、反刍杆菌属、琥珀酸弧菌属、F082、未知琥珀酸弧菌科细菌属、拟杆菌目RF16细菌属、产琥珀酸菌属、UCG-011等10种菌属，其中普氏菌属和理研菌科RC9为瘤胃中的优势菌属；与A组相比，B组琥珀酸弧菌属的丰度显著降低(P<0.05)，其余菌属在两组间差异均不显著(P>0.05)。

表9瘤胃细菌在属水平菌群结构

2.3.5 瘤胃微生物相对丰度与CH4产量、产气量和瘤胃发酵参数的相关性

由相关性热图(图3、4)可知，在瘤胃门水平前10种细菌中，螺旋体菌门、纤维杆菌门与CH4产量、产气量和瘤胃发酵参数有显著相关性。螺旋体菌门与丙酸和NH3-N含量呈显著负相关(P<0.05)；纤维杆菌门与pH呈显著正相关(P<0.05)，与戊酸、丁酸、乙酸、CH4和NH3-N含量呈显著负相关(P<0.05)。在瘤胃属水平前10种细菌中，理研菌科RC9和拟杆菌目RF16细菌属与CH4产量、产气量和瘤胃发酵参数有显著相关性。理研菌科RC9与NH3-N含量呈显著正相关(P<0.05)；拟杆菌目RF16细菌属与戊酸、丁酸、乙酸、CH4和NH3-N含量呈显著正相关(P<0.05)。

图3 门水平瘤胃微生物相关性热图

 

图4 属水平瘤胃微生物相关性热图

2.3.6 黑曲霉对瘤胃微生物的影响

由图5所示，与A组相比，B组细菌和产甲烷菌的绝对含量显著增加(P<0.05)，原虫的绝对含量显著减少(P<0.05)。

图5瘤胃微生物的绝对含量

3 讨论

3.1 黑曲霉对瘤胃体外发酵参数的影响

瘤胃的酸碱平衡对反刍动物的整体健康状况至关重要，过低的pH会导致瘤胃酸中毒，影响瘤胃微生物的活性，进而影响动物的食欲和营养吸收。本试验中，黑曲霉的添加显著提高了奶牛体外瘤胃液的pH，但其符合瘤胃pH正常范围。VFA作为肠道微生物发酵的产物，是反刍动物重要的能量来源，其产生速率也会影响营养物质的分配，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等短链脂肪酸。在反刍动物体内，大部分乙酸可以通过三羧酸循环生成脂肪酸，丙酸可以通过糖异生作用生成葡萄糖，丁酸可为动物机体提供能量。饲粮中的纤维性碳水化合物和非纤维性碳水化合物发酵的主要产物分别是乙酸和丙酸。在本试验中，各组的乙酸、丙酸、丁酸、乙酸/丙酸比值以及总挥发性脂肪酸无显著差异，说明黑曲霉的添加对奶牛的瘤胃体外发酵模式没有影响。反刍动物瘤胃微生物可以将饲料蛋白质降解为NH₃-N，其中一部分的NH3-N被瘤胃微生物利用合成MCP，进而被动物消化吸收。瘤胃中NH3-N的浓度与MCP合成量可以作为衡量氮代谢的重要指标。MCP含量可反映微生物对氮的利用效率，也可间接反映瘤胃微生物菌群的数量。在本试验中，与A组相比，B、C和D组的NH3-N含量显著降低，C和D组的MCP含量显著升高，而B组的MCP含量显著降低。因此推测，C、D组黑曲霉的添加可以促使奶牛瘤胃内更多的氮源被微生物用于生长和繁殖，而不是以NH₃-N形式积累，提高了奶牛瘤胃的氮利用率。但B组黑曲霉的添加可能减少了瘤胃微生物菌群的数量，其具体原因需要进一步去讨论。

3.2 黑曲霉对瘤胃发酵气体代谢的影响

产气量可以反映营养物质被瘤胃微生物消化利用的情况，通常情况下，饲料中可发酵营养物质越多，瘤胃微生物活性越强，产气量越多。在本试验中，A、C、D组间的产气量差异不显著，且显著高于B组。另外，结合B组MCP含量显著降低的试验结果，说明B组黑曲霉的添加减少了瘤胃微生物的活性，从而降低了饲料利用率，而C、D组黑曲霉的添加不影响奶牛对于饲料的利用率。在反刍动物的瘤胃中，CH4生成的主要途径是通过饲料中富含的纤维素、半纤维素等结构性碳水化合物在微生物所分泌的生物酶作用下，经过一系列氧化还原反应转化成为VFA，并在整个代谢过程中生成H₂和CO2，再经产甲烷菌将H2和CO₂还原生成不能被消化利用的CH4，进而通过嗳气将其排出体外。另外，乙酸发酵途径也是CH4生成的重要途径，乙酸、丙酸等VFA在产甲烷菌作用下生成CH4。在畜牧生产过程中，反刍动物的瘤胃发酵产生了大量CH4。，加剧温室效应。在本试验中，试验组VFA含量数值上虽然有所减少，但差异不显著。另外，与A组相比，B、C组CH4产量均显著下降，而D组差异不显著。并且，A组CH4产量占总产气量比值显著高于B、C组，说明B、C组黑曲霉的添加可以降低奶牛瘤胃体外发酵的CH4产量，进而减少温室气体的排放。

3.3 黑曲霉对瘤胃微生物多样性的影响

微生物 Alpha和 Beta多样性分析可以直接反映瘤胃菌群构成的丰富性及多样性，从而反映动物机体的生理功能和健康状况。Alpha多样性较高的瘤胃微生物群落能够提高牛对饲料中营养物质的消化率。Beta多样性较高的瘤胃微生物群落则意味着不同物种在群落中占据平衡，有助于提升群落的适应性和稳定性，对于动物机体的生理功能和健康状况至关重要。在本试验中，基于B、C组瘤胃液的总产CH4量以及CH4产量占总产气量的比值显著低于A组，且B组瘤胃液的总产CH4量在数值上低于C组，后续试验选择了A组和B组进行瘤胃微生物多样性分析。A组和B组体外发酵瘤胃液中微生物的Alpha和Beta多样性无差异，表明黑曲霉的添加不会破坏瘤胃微生物群落的平衡和稳定。另外，瘤胃微生物的组成和相对丰度结果显示，与A组相比，B组琥珀酸弧菌属的丰度显著降低。黑曲霉提高瘤胃液pH，减少那些在较低pH条件下更活跃的微生物如琥珀酸弧菌属的丰度，琥珀酸弧菌属属于产琥珀酸的细菌，它降低可能会导致VFA产生比例的改变，减少琥珀酸的生成，有利于降低瘤胃酸中毒的风险。通过Spearman相关性分析，研究瘤胃细菌微生物与瘤胃发酵参数、CH4产量和产气量之间相互影响的关系，结果表明，在瘤胃液中门水平前十的细菌中，螺旋体菌门与丙酸和NH₃-N含量呈显著负相关；纤维杆菌门与pH呈显著正相关，与戊酸、丁酸、乙酸、CH4和NH3-N含量呈显著负相关；在瘤胃液中属水平前十的细菌中理研菌科RC9与NH3-N含量呈显著正相关；拟杆菌目RF16细菌属与戊酸、丁酸、乙酸、CH4和NH₃-N含量呈显著正相关。在本试验中，B组瘤胃中螺旋体菌门、纤维杆菌门丰度值上高于对照组A组，且理研菌科RC9和拟杆菌目RF16细菌属丰度值上低于对照组A组，可能与B组瘤胃液pH的提高以及CH4和NH3-N含量的减少相关。研究表明，产甲烷菌大多是附着在原虫或原虫胞质的氢化酶体上，并且存在一个共生关系，利用氢转化成CH4，因此对原虫丰度的调控也会导致CH4产量大大减少。另外，细菌是瘤胃内最大的微生物种类，它的种类和数量反映了瘤胃内微生物稳态的平衡。在本试验中，对瘤胃微生物的绝对含量进行分析，结果表明，黑曲霉添加可以显著增加细菌和产甲烷菌数量，但急剧减少了原虫数量，与B组CH4产量的降低相对应。此外，下一步将进行动物试验进一步研究。

4 结论

奶牛体外瘤胃发酵液中添加黑曲霉在不改变发酵模式的同时，通过调节瘤胃微生物群落结构，影响NH3-N的产生和CH4的排放。

参考文献：略。

作者：李若楠，王昊天等发表于《中国畜牧兽医》2025年第2期。