乳酸菌共培养提高罗伊氏乳杆菌抑菌活性的条件优化研究

 

摘要：乳酸菌的抑菌性可以通过与诱导菌之间的共培养得到显著提升。试验旨在用鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌，以抑菌圈直径为考察指标，测定罗伊氏乳酸乳杆菌与不同乳酸菌共培养对其抑菌活性的影响。结果表明：罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌的共培养能有效提高抑菌活性。优化的共培养条件为装液量160 mL/250mL，接种量3%，罗伊氏乳杆菌，副干酪乳杆菌接种比例2∶1，培养时间 28h，温度为37℃，优化的培养基中碳源为乳糖，氮源为蛋白胨。此条件下罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌共培养的上清液对5株指示菌的抑菌圈平均直径与罗伊氏乳杆菌单独培养相比提高了37.3%。

关键词：罗伊氏乳杆菌；副干酪乳杆菌；抑菌活性；共培养；条件优化

乳酸菌是一类存在于人类和动物肠道、粪便及营养丰富的食品中的微生物，乳酸菌素是乳酸菌在生长代谢过程中产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽，这些物质可以杀灭或抑制同一生态系统中竟争营养物质的敏感细菌。这种天然的抗菌素具有高效、无毒副作用、无残留、无抗药性等特性，对动物机体无害，被广泛应用于蛋白质工程、饲用添加剂等方面。

乳酸菌素合成量低，限制了其应用。已有研究表明，与一些诱导菌共培养能够增加乳酸菌细菌素的产量。如植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌共同培养可使单核增生李斯特菌的抑制效果增强；乳酸球菌、植物乳杆菌与副干酪乳杆菌共培养，能够更好地抑制猪肉中单核增生李斯特菌的增殖，延长腌制食品的货架期；副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌共培养能够产生更多的抑菌素，有更强的抑菌效果。

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reutrei)是一种重要的动物微生态制剂中的益生菌，具有很强的肠黏附能力，具有抑制胃肠道病原菌繁殖、调节动物免疫机能、调节肠道菌群、预防或减轻腹泻、提高饲料利用效率、促进动物生长等优点。罗伊氏乳杆菌的抑菌活性主要来自于罗伊氏菌素，目前对罗伊氏菌的共培养体系和诱导菌类型以提高其抑菌活性的报道很少。基于此，本研究以增强抑菌活性为目标，从用作饲料添加剂的乳酸菌中筛选与罗伊氏乳杆菌共培养的乳酸菌，并进一步通过优化共培养条件研究罗伊氏乳杆菌的共培养机制。研究结果可为罗伊氏乳杆菌混合微生物制剂的进一步应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，由四川轻化工大学生物技术发酵实验室提供；饲料添加剂乳酸菌包括屎肠球菌20433(Enterococcus faecium)、粪肠球菌20175(Enterococcus faecalis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌1.12731(Lactobacillus paracasei)、布氏乳杆菌1.5607(Lactobacillus buchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus beijerinck)、植物乳杆菌1.38(Lactobacillus plantarum)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：指示致病菌包括福氏志贺氏菌51572(Shigella castellani)、鼠伤寒沙门氏菌14028(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌25922(Escherichiacoli)、单核增生李斯特菌19111(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌4330(Staphylococcusaureus)，购自上海鲁微科技有限公司。

1.1.2 化学试剂

蛋白胨、胰蛋白胨、䏡蛋白胨、大豆蛋白胨、琼脂粉、牛肉粉、酵母浸粉，购自国家集团化学试剂有限公司；葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、尿素、乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、吐温80、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠(均为分析纯)，购自北京化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

NB培养基：牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、蛋白胨10.0g、纯化水1000 mL。

MRS 培养基：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏8.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、纯化水1000 mL。

1.1.4 仪器与设备

紫外可见分光光度计(型号为UV752N)，购自上海佑科仪器仪表有限公司；立式智能精密摇床(型号为BSD-YX3200)，购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅(型号为YXQ-75SII)，购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司：电热恒温培养箱(型号为HN-50BS)，购自上海力辰仪器科技有限公司；超净工作台(型号为ZN-SB-0023)，购自上海力辰仪器科技有限公司；高速离心机(型号为TG-16)，购自四川蜀科仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌和指示菌种子液的制备

将保藏的乳酸菌划线接种于MRS琼脂培养基，37℃活化24h，然后接种于MRS液体培养基 37 ℃静置培养24h。将指示菌接种于琼脂培养基中活化24h后，在NB液体培养基中37℃、180r/min条件下摇床培养24 h。

1.2.2 无菌上清液的制备

将乳酸菌种子液以2%接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养24h。取10 mL培养液在4℃条件下10000r/min离心10min，取上清液以0.22μm滤膜过滤后4℃保存备用。

1.2.3 抑菌活性检测

采用牛津杯平板法测定菌株抑菌活性，分别吸取100μL 5种指示菌的培养液涂布于营养琼脂培养基，放入牛津杯，加200μL的乳酸菌无菌上清液，4℃静置6h，再于37℃培养18h，测量抑菌圈直径大小作为抑菌能力的评价指标。

1.2.4 生物量检测

将3mL 菌悬液于12000 r/min离心2 min，弃上清液，用去离子水重悬至3mL，测定600 nm处的吸光度(OD600值)。

采用稀释涂布平板计数法，取100μL适当稀释的培养液均匀涂布于固体培养基，37℃置培养24h，进行菌落计数。

1.2.5 共培养乳酸菌的筛选

将活化好的各种乳酸菌与罗伊氏乳杆菌组合，按2%接种量接于含有MRS 液体培养基的250mL三角瓶中，恒温下静置共培养一定时间，测定菌液无菌上清液对5种指示菌的平均抑菌圈直径：以乳酸菌单独培养为对照。

1.2.6 诱导菌的作用方式

将诱导菌副干酪乳杆菌进行如下处理：①将副干酪乳杆菌纯培养发酵液5000r/min 离心5min，弃上清液，用生理盐水清洗3遍，即得菌悬液；②将菌悬液在121℃灭活15 min，得灭活菌悬液；③用 0.22 μm细菌过滤膜处理发酵上清液，得无菌发酵上清液；④在无菌发酵上清中加入2mg/mL蛋白酶K，在pH7.5条件下37℃孵育2h，再于80℃加热15min灭活酶，即得酶解无菌发酵上清液；将上述溶液按1.2.5方法与罗伊氏乳杆菌共培养后检测抑菌活性，以纯培养罗伊氏乳杆菌为对照。

1.2.7 共培养乳酸菌的培养条件优化

将罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌按1.2.5方法进行共培养，分别设置不同的培养时间(4～36h)、装液量(130mL/250mL、140 mL/250mL、150mL/250mL、160 mL/250 mL、170 mL/250 mL)、接种量(1%、2%、3%、4%、5%)、接种比例(1∶2、2∶1、1∶1、1∶4、4∶1)以及培养温度(25、29、33、37、41℃)，测定抑菌圈直径，确定对罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌共培养的条件。

1.2.8 培养基优化

在此基础上，分别设置添加量为2%的不同碳源(葡萄糖、糖蜜、蔗糖、乳糖、麦芽糖)、添加量为1%的氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、䏡蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素)测定抑菌圈直径，确定对罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌共培养的培养基配方。

1.3 数据统计与分析

采用Origin 2021、SPSS26软件对数据进行显著性差异分析并绘图，结果以平均数±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 共培养乳酸菌的筛选

由表1可知，乳酸菌均对5种指示菌具有抑菌作用，除了粪肠球菌和屎肠球菌，不同的乳酸菌与罗伊氏乳杆菌共培养后都能提高罗伊氏乳杆菌的抑菌活性，且共培养后的抑菌圈平均直径高于乳酸菌单独培养.其中罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌共培养后的抑菌圈平均直径为(15.80±0.20)mm，显著高于各自单独培养和其他共培养组合方式(P<0.05)，相较于罗伊氏乳杆菌单独培养提高了17.82%。因此选择罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌进行共培养条件优化试验。

表1不同乳酸菌共培养罗伊氏乳杆菌的抑菌圈直径(mm)

注：同列数据的肩标不含有相同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)；下表同。

2.2 诱导菌的作用方式

由图1可知，副干酪乳杆菌的菌悬液能显著提高罗伊氏乳杆菌的抑菌活性，抑菌圈直径显著增加(P<0.05)。这表明罗伊氏乳杆菌的细菌素合成受副干酪乳杆菌活菌的诱导，而诱导菌的死菌、无菌上清液及无蛋白上清液对罗伊氏菌抑菌活性无显著影响(P>0.05)，不能诱导罗伊氏菌细菌素的合成。另一方面，只有副干酪乳杆菌的活菌悬浮液提高了共培养体系的生物量，其余处理条件下的罗伊氏菌生物量都没有显著增长(P>0.05)，这也表明诱导菌活菌体能促进罗伊氏乳杆菌的生长。

2.3 共培养条件优化

2.3.1 培养时间的影响

由图2可以看出，在接种量相同的情况下，罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌共培养体系与罗伊氏乳杆菌单独培养的生长曲线趋势大致一致，在4h以前处于延滞期，4～8h内进入了对数生长期，在8～20h时增长速度逐渐放缓，在24h后进入了稳定期。但在每一个生长阶段，共培养体系的生物量和活菌数均大于对照，这表明诱导菌的存在促进了罗伊氏乳杆菌的生长，增加了其生物量。另一方面，从抑菌圈直径曲线来看，在4～8h内抑菌活性增加最快，8～20h抑菌活性缓慢增加，28h之后活性有所下降。同时，不同生长时期的共培养体系的抑菌活性均大于单独培养。从结果来看，共培养体系的培养时间确定为28h。

图2罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌组合共培养生长曲线及抑菌活性变化

2.3.2 装液量的影响

由表2可知，不同装液量的罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌共培养发酵液对5种指示菌均有抑菌作用，装液量在160mL/250mL时，除单核增生李斯特菌外，对其他4株致病菌的抑菌活性达到最高。装液量对罗伊氏乳杆菌的生长和抑菌物质的产生具有一定影响。因此，确定最适装液量为160 mL/250mL，该条件下抑菌圈平均直径为16.19mm。

表2装液量对不同指示菌抑菌圈直径的影响(mm)

2.3.3 接种量的影响

由表 3可知，随着接种量的增加，抑菌活性逐渐升高，接种量为3%时抑菌活性达到最大。抑菌圈平均直径为16.77mm，而接种量大于3%时抑菌活性有所降低。接种量对细菌的生长影响较大，接种量过小，发酵液中初始浓度偏低，会降低菌体在单位时间内产抑菌物质的产量。而接种量过大，导致发酵液中初始菌浓度偏高，减小菌体扩增倍数，从而降低细菌素的产生。因此，将3%定为最佳接种比例。

表3接种量对不同指示菌抑菌圈直径的影响(mm)

2.3.4 接种比例的影响

由表4可知，不同接种比例之间的抑菌效果差别显著，罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌接种比例 2∶1时，对5种指示菌的平均抑菌圈直径最大，抑菌效果最好，对单核增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果显著高于其他接种比例(P<0.05)。最终确定接种比例为2∶1进行后续试验，该条件下抑菌圈平均直径为17.45mm。

表4接种比例对不同指示菌抑菌圈直径的影响(mm)

2.3.5 培养温度的影响

由表5可知，不同培养温度下的培养液抑菌活性不同，随着培养温度的升高，培养液对5种指示菌的抑菌作用逐步增强，并在37℃时达到最大抑菌效果，而在41℃时对5株菌的制作用开始减弱。此外，33℃时对志贺氏菌的抑菌性最强，在37℃时有所下降。这种不一致的变化可能是由于各指示菌对抑菌物质的敏感性不同。

表5培养温度对不同指示菌抑菌圈直径的影响(mm)

2.4 培养基的优化

2.4.1 碳源的影响

由表6可知。罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌利用不同碳源共培养均能产生抑菌物质，其中利用葡萄糖对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌、利用麦芽糖对单核增生李斯特菌均显示了较好的抑制效果；而利用糖蜜和蔗糖培养时的抑菌效果较差；利用乳糖进行共培养时，对5种指示菌具有最好的抑菌效果，抑菌圈直径达到最大，为18.27 mm。

表6碳源对不同指示菌抑菌圈直径的影响(mm)

2.4.2 氮源的影响

由表7可知，对于单一指示菌来说，利用大豆蛋白胨对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，利用䏡蛋白胨对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果，利用胰蛋白胨对大肠杆菌均具有较好的抑菌效果，利用尿素培养时的抑菌效果较差。利用蛋白胨进行共培养时，对5种指示菌具有最好的抑菌效果，抑菌圈直径达到18.44 mm.

表7 氮源对不同指示菌抑菌圈直径的影响(mm)

3 讨论

3.1 罗伊氏菌共培养诱导菌的筛选和作用方式

在禁抗的趋势下，利用益生菌制剂替代抗生素作为新型饲料添加剂，已广泛应用到畜禽养殖生产实践中。我国农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》规定了35种微生物可作为饲料添加剂使用，其中较为常见的饲用乳酸菌包括粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等。这些乳酸菌能在肠道内成为优势菌群，可抑制有害微生物的繁殖，并提高饲料适口性。罗伊氏乳杆菌作为益生菌在抑制病原菌生长和免疫调节能力方面发挥重要作用。在罗伊氏菌使用的过程中常有与其他乳酸菌共同添加的情况，因此与诱导菌共同使用能使罗伊氏菌发挥事半功倍的作用。

以往的研究表明，诱导菌共培养可以显著提高目标乳酸菌生物量、乳酸菌素产量，但不同乳酸菌的最佳诱导菌不同，这与乳酸菌自身特性有关，如哈尔滨乳杆菌与植物乳杆菌互利共生，二者共培养生长及增殖更为稳定，抑菌效果增强，抑菌圈直径提高了约20%；卷曲乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌和肠膜明串珠菌的活菌共同培养后，发酵液抑菌活性明显增加；罗伊氏乳杆菌与植物乳杆菌共培养后，后者的抑菌活性显著增加。罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌均具有抑菌功能，但关于罗伊氏乳共培养的乳酸菌鲜有报道，本研究首次确定了增强罗伊氏乳杆菌抑菌活性的诱导乳酸菌类型为副干酪乳杆菌。

在同一培养体系中的乳酸菌之间存在着协同作用，在共培养过程中通常伴随着协同代谢、群体感应等错综复杂的微生物种间关系以及次级代谢产物的变化，这种作用与诱导菌的性质和代谢物有关。在一些报道中，诱导菌的无菌上清液也能够起诱导作用；大部分报道均表明，活菌体起诱导作用，如对于植物乳杆菌来说，细菌素的合成并非来自于诱导菌分泌到培养基中的诱导分子，而是需要活的诱导细菌。这可能是由于诱导因子存在于诱导菌的细胞表面，需要以与目标细胞相结合才能发生促进细菌素的合成。本试验结果与这些报道相符，副干酪乳杆菌的菌体能提高罗伊氏菌的抑菌活性，表明罗伊氏乳杆菌的细菌素合成也受活菌诱导，共培养发酵液的抑菌性能的提升与细胞之间接触有关。另一方面，在相同接种量下共培养体系的生物量更多，表明诱导菌引起的效应可能与群体感应有关。

3.2 罗伊氏菌共培养条件优化

共培养的生长曲线和抑菌曲线显示，在生长曲线的每一个阶段，诱导菌的存在都促进了罗伊氏乳杆菌的生长，增加了其生物量。相应地，共培养体系每个生长时期的抑菌活性均大于单独培养。这说明罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌共培养体系符合诱导的群体感应特征。菌体产生的诱导分子提高了菌体密度，在达到一个阈值后诱导了乳酸菌素合成，进而提高了抑菌活性。

装液量和接种量影响罗伊氏菌共培养的溶氧情况和初始浓度，从而影响菌的生长。在一些文献中，乳酸菌共培养的接种量在1%～3%，如对副干酪乳杆菌共培养接种量为1%，复合乳酸菌的接种量为3%，植物乳杆菌的共培养接种量为2%。本研究中最适接种量为3%，可能与乳酸菌类型有关。

乳酸菌共培养时，适宜的接种比例可促进细胞密度的增加，进而某种信号分子合成量不断增加，当浓度达到阈值时，可以激活细菌素的合成。不同的乳酸菌对诱导菌的比例要求不同，这可能与诱导菌的特异性有关。如植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在接种比例为1∶5时，抑菌作用更强，对金黄色葡萄球菌的抑制率达到95%。干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌接种比例为20∶1时抑菌圈直径达到最大，与其他接种比例相比差异显著。本研究中适宜比例的副干酪乳杆菌在增殖过程中可能通过复杂的生物之间相互作用，为罗伊氏乳杆菌提供了更适宜的生长条件，进而诱导了罗伊氏菌素的合成。

在不同培养温度下，菌株的代谢活动和产生的抑菌物质有差异，这种差异和指示菌敏感性的差异，导致不同温度下培养液对各指示菌的抑制效果不同，如棉籽糖乳球菌Y-12 在培养温度35℃时抑菌效果达到最佳，嗜酸乳杆菌产细菌素的最佳温度为37℃。本研究中37℃为最佳温度，该条件下抑菌圈平均直径为17.71 mm。

3.3 罗伊氏菌共培养的培养基优化

乳酸菌共培养的生长情况还与培养基成分有关，尤其是碳源和氮源。碳源类型对于乳酸菌的生长及抑菌物质合成有着重大的影响。不同乳酸菌或不同培养方式对碳源的要求不同。如对干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌的共培养来说，1.32%葡萄糖和0.68%蔗糖碳源可以显著提高发酵上清液的抑菌活性。而对于罗伊氏乳杆菌的单独培养，在优化的碳源1.00%葡萄糖+10.00%蔗糖或6.26%葡萄糖+5.26%果糖时，发酵上清液的抑菌效果最强。本试验中，以乳糖为碳源时的抑菌效果最好，这个结果与MRS的组成成分葡萄糖不同，表明在共培养时对碳源的需求与单独培养不同。罗伊氏乳杆菌是多氨基酸营养缺陷菌株，对外源蛋白质和无机氮源的利用较差。因此，以尿素为氮源的抑菌效果较差。据报道，罗伊氏乳杆菌的优化氮源包括胰蛋白胨、酵母提取物和盐酸氨基脲。本试验中，罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌的共培养的氮源为蛋白胨，表明共培养的氮源与单独培养不同，应通过试验加以优化。

罗伊氏乳杆菌与副干酪乳杆菌共培养可以显著增强发酵上清液的抑菌活性，并优于其他的共培养组合和单独培养。本研究对罗伊氏乳杆菌共培养诱导体系的培养条件和培养基进行优化，可为罗伊氏乳杆菌剂的开发提供试验基础。

4 结论

本试验通过罗伊氏乳杆菌与对8株饲料添加剂乳酸菌共培养，确定了副干酪乳杆菌作为诱导菌可以显著提高罗伊氏乳杆菌的抑菌活性。优化的共培养条件：以MRS培养基为基础的乳糖碳源和蛋白胨氮源，培养基装液量160 mL/250 mL，菌株接种量3%，罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌接种比例2∶1，37℃培养28h，此条件下的共培养上清液对5种指示菌的抑菌圈直径达到18.44mm，比罗伊氏乳杆菌单独培养的抑菌圈直径提高了37.3%，证实了副干酪乳杆菌对罗伊氏菌素的诱导合成作用。

参考文献：略

作者：李小梅，格让拉姆等2025-04-14网络首发于《饲料工业》