抗菌肽基因表达系统研究进展

摘要：抗菌肽是生物体产生的一种阳离子短肽，具有天然的抗菌活性。由于抗菌肽具有与传统抗生素不同的作用机制，不产生耐药性，因而具有重要的临床应用价值，可作为新型绿色、安全、环保的饲料添加剂。但是怎样用廉价的方式大量地得到抗菌肽是对它进行深入研究和广泛应用的前提，基因重组的方法可能是最经济的获得大量抗菌肽的方法，许多研究对不同来源的抗菌肽进行了重组表达的尝试，涉及的表达系统包括大肠杆菌系统、酵母系统、昆虫系统。针对近年来抗菌肽开发的基因工程策略和实践，尤其是大肠杆菌表达系统和酵母表达系统，文中进行了简要综述。
关键词：抗菌肽；基因表达；大肠杆菌；毕赤酵母
中图分类号 S816.15
抗菌肽(Antibacterial peptide)是生物细胞特定基因编码、经特定外界条件诱导产生的一类多肽，具有相对分子质量小、热稳定、杀菌范围广、作用机制独特等特点。一般由20～60个氨基酸残基组成，分子量约为2～7 kD,其分布极其广泛，从细菌到植物、软体动物、两栖动物、鱼类、鸟类和哺乳动物体内都有其存在。多数抗菌肽的等电点大于7,呈现较强的阳离子特征。其水溶性好，耐热性能高，100 ℃加热10 min仍能保持一定的活力。抗菌肽对较大离子强度或较高、较低的pH值环境都有较强的抗性。由于抗菌肽本身所具有的特点，它已经越来越多地作为一种潜在的抗菌药物引起了人们的兴趣，用廉价的方式大量地得到抗菌肽是对它进行深入研究和广泛应用的前提。
传统方法主要是用生物化学方法直接分离抗菌肽，再研究其结构特点与功能活性。通过人工诱导内源性抗菌肽的表达，一般是注射抗原后通过获得组织匀浆，再进行分离纯化和活性研究。但分离提纯具有抗菌活性的组分无疑是一件非常繁琐的工作，且不同的实验条件对于组分的纯度影响很大。天然存在的抗菌肽产量很低，无法从动植物体内大量提取；而化学合成肽价格昂贵, 所以国内外都将目光瞄向利用基因工程技术生产抗菌肽。而基因重组表达的方法可能是最经济的获得大量抗菌肽的方法。但是，由于抗菌肽是小分子的碱性多肽，极易受到蛋白酶的攻击，而且表达产物往往对宿主细胞有毒性，因此，抗菌肽的外源表达较其它多肽类药物更为困难。有许多实验对不同来源的抗菌肽进行了重组表达的尝试，涉及的表达系统包括大肠杆菌系统、酵母系统等。
1 抗菌肽基因在大肠杆菌中的表达
1.1 大肠杆菌
在过去的20年里,人们对大肠杆菌系统的遗传学、生物化学和分子生物学方面有了充分的认识,使之成为表达许多外源蛋白的首选表达系统。大肠杆菌遗传图谱明确,易培养、周期短、费用低,对许多蛋白质有较强的耐受能力,能较高水平地表达多种蛋白。所以大肠杆菌是应用于DNA重组技术的主要宿主细菌。
1.2 抗菌肽基因在大肠杆菌中的表达策略
1.2.1 密码子优化
稀有密码子在真核与原核细胞中对基因表达有着相似的影响，往往会显著降低抗菌肽基因的表达水平。大肠杆菌基因对密码子的使用有相当程度偏爱性，表现为在同一密码子家族中只有1~2个密码子被频繁使用，大肠杆菌稀有密码子如编码Ser的TCG、TCA，编码Leu的CTG、CTA等，其使用频率几乎是0。一般来说，含有较高比例的稀有密码子(或稀有密码子连续出现)的外源基因，在翻译过程中容易发生中止或移码突变，影响基因的高效表达，甚至不表达。真核细胞对密码子的使用限制程度虽不如原核细胞，但将稀有密码子替换为表达宿主偏爱的密码子后，表达水平会显著提高。要克服基因中稀有密码子对表达效率的负面影响，以往通常采用以下两种方法着手加以解决:①共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因；②用点突变的方法改变某些碱基。但对于抗菌肽小分子而言，这两种方法均显繁琐，由于分子量小，直接根据表达宿主密码子偏爱性设计合成抗菌肽的编码基因，对抗菌肽而言是一种更为方便有效的方法。抗菌肽通常富含某种氨基酸，如Arg、Cys等，研究表明，几个稀有密码子成簇存在时对基因在宿主中的表达影响尤为严重，因此野生型抗菌肽基因很难高效表达，通常不表达(张雅丽等，2002)。Li等将人β-防御素基因改造为大肠杆菌的密码子偏爱的基因，在大肠杆菌中获得高效融合表达，融合蛋白占细菌总蛋白的50%以上，是野生型基因的9倍。为获得最优表达效率，采用表达宿主偏爱密码子，设计并合成编码抗菌肽基因，从而避免不同物种对不同密码子使用频率的不同对表达效果产生负面影响。
1.2.2 融合表达
由于抗菌肽分子小，易被宿主菌中的蛋白酶降解，而且表达产物对原核宿主菌具有杀伤作用，难以在原核表达体系中直接表达具有天然生物活性的抗菌肽。防止抗菌肽对表达宿主菌的伤害，是提高抗菌肽基因表达水平的关键问题。现在一般采用以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达抗菌肽基因。融合蛋白表达法是在抗菌肽的N端连接一段适合在细菌中表达的蛋白质序列，宿主菌表达出这样的融合蛋白没有杀菌活性，不会对宿主造成伤害，从而提高了抗菌肽基因的表达水平。同时，抗菌肽是一段短肽，容易被胞内酶降解，融合蛋白表达也可以防止短肽的降解。Rao等在选择与抗菌肽融合表达的载体蛋白时遵循了以下的4个条件:第一，载体蛋白应比所要表达的抗菌肽大3~4倍；第二，载体蛋白的等电点必须比目标多肽低至少2个pH值单位;第三，载体蛋白应该是亲水性的；第四，这个蛋白对宿主无害。由于融合蛋白通常是来源于大肠杆菌自身的蛋白，且具有分子伴侣的功能，因此，融合表达不仅可以提高抗菌肽的表达量，还可以帮助其正确折叠，从而获得可溶蛋白。目前成功的融合表达系统主要有：①谷胱甘肽转移酶(GST)系统，融合蛋白通过谷胱甘肽——Agarose进行亲和纯化后，用凝血酶或Xa-因子切除融合蛋白的GST部分，获得目的蛋白。②β-半乳糖苷酶系统，融合蛋白用氨基苯硫代半乳糖苷酶（TPEG）——Sepharose进行亲和纯化。③麦芽糖结合蛋白(MBP)系统，通过直链淀粉交联纤维素亲和层析分离纯化。
1.3 抗菌肽基因在大肠杆菌中的表达
选用大肠杆菌偏好的密码子，设计合成好抗菌肽基因，将抗菌肽基因克隆到含有蛋白伴体的专门的融合表达载体(如pET、pGEX、pGEM、pMAL等系列)然后转化入相应的大肠杆菌宿主细胞，最后再经诱导、酶切而得到抗菌肽基因表达的蛋白。1996年，Hara等将42个氨基酸的家蚕抗菌肽Moricin分别与β-半乳糖苷酶和麦芽糖结合蛋白融合，在大肠杆菌中获得了表达,得到了与天然Moricin一级结构和分子量相同的多肽,从2 L发酵液的菌体中得到了11 mg纯度为90%以上的重组Moricin。Harder等（2001）将人β-防御素3（hBD3）的基因克隆入N端带有组氨酸标签的pET-30c载体，以融合方式在大肠杆菌BL21中进行表达，产物用肠激酶切割后反向高效液相色谱纯化，结果获得了高纯度的rhBD3蛋白，其活性水平与人工合成和提取的天然多肽一致。Peng等(2004)将人β-防御素2(hBD2)的基因插入到pET-32a(+)中构建融合表达载体，以大肠杆菌BL21为工程菌，在10 L发酵罐中进行IPTG诱导表达，通过调整各种参数实现了hBD2的可溶性表达，产量达到 1.31 g/l，占菌体可溶性蛋白总量的41.6％，纯化后的蛋白具有抗菌活性，该研究显示了应用基因工程技术大规模制备抗菌肽的可能。Moon等(2006) 以pGEX-4T3为载体，在大肠杆菌BL21中以与GST融合的方式表达了37个氨基酸残基的具有α-螺旋结构的两性阳离子多肽，即人杀微生物肽(Human cathelicidin)LL-37，目标蛋白用因子Xa切割下来，再用 RP-HPLC进行纯化，最后获得了0.3 mg/l的产量，该产量仅够满足一些针对该蛋白结构等方面的基础研究。Li 等（2006）采用大肠杆菌融合表达系统成功表达了抗菌肽 LL-37，表达产物以融合蛋白形式得到，需要去除融合伴侣后才能表现应有的抗菌活性。杨旭（2006）利用GST融合表达系统在大肠杆菌中正常表达了抗菌肽基因Pexiganan和IB-367，表达产物经Xa因子酶切后显示出抗菌活性。李伟等（2007）将牙鲆抗菌肽Hepcidin基因重组至融合表达载体pGEX-4T-1中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)plyS中，表达的融合蛋白最高占总蛋白的21%。纯化得到的融合蛋白用凝血酶切割后，用亲合层析得到牙鲆的抗菌肽 hepcidin。抑菌实验结果表明抗菌肽对大肠杆菌（ATCC25922）有一定程度的抑制作用。Lu等（2008）以pET28α为载体，将经改造后的人胰岛素原（mhpI）与GK1的融合基因（mhpI-GK1）转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。抑菌活性实验表明纯化后的重组GK1和化学合成GK1具有相同的抗菌活性，为基因工程方法大规模生产GK1奠定了基础。
1.4 抗菌肽基因在大肠杆菌中表达的影响因素
抗菌肽基因其自身的性质就是影响表达水平的重要因素，mRNA 5'端非翻译区(5'-UTR)的核苷酸序列和长度影响基因的表达，SD序列位于密码子的上游3~11个核苷酸处,与核糖体16S rRNA的3'互补配对，一般为富含GA的5个核苷酸。起始密码子与SD序列间的适宜距离为4～10个核苷酸。UTR太长或太短都会造成40S亚基的识别障碍，影响基因的有效表达。A+T含量高的基因常会由于提前终止而不能有效转录，因此对 AT含量丰富的基因最好是重新设计序列，使A+T含量保持在30％～55％，来避免提前终止的发生。包涵体的形成是细胞内表达最大的问题，它是细菌表达的蛋白在胞内相互凝集而形成的无活性固体颗粒，具很强的折光性。包涵体的形成是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态之间的特异性错误聚合，致不形成成熟的天然或完全解链的蛋白。包涵体虽然利于分离纯化，但是对表达产物的活性不利。通过改变发酵条件，如降低发酵温度、加入不能代谢的糖、降低培养基的pH值等来改善蛋白的溶解性。然而大肠杆菌表达系统也常常无法得到有活性的抗菌肽，一方面可能因为在原核表达系统中抗菌肽的二硫键无法正确形成，影响了蛋白的正确折叠，导致无活性；另一方面在原核表达系统中抗菌肽无法得到酰胺化修饰，也会影响其活性。
2 抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达
2.1 毕赤酵母
酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力,并且不会产生内毒素,是基因工程中良好的真核基因受体菌。近年来应用最为广泛的是毕赤酵母。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母,能利用甲醇作为唯一碳源。它拥有一个很强的可被诱导的甲醇利用途径,乙醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径的第一个酶，甲醇是这个酶的诱导剂,而葡萄糖、乙醇、甘油等则是抑制剂。在毕赤酵母中有两种基因编码乙醇氧化酶(即AOX1和AOX2)。细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供的。AOX1基因启动子是个很强的启动子,外源蛋白的表达往往利用这个启动子。在甲醇培养的细胞中,该酶可占细胞总蛋白的30％以上。AOX2与AOX1的同源性虽然高达97％,但只承担很少一部分活力。当AOX1基因缺失只存在AOX2时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,细胞利用甲醇能力降低,细胞在甲醇培养基上生长很慢,这种菌株被称为MutS（Methanol utilization slow）；AOX1基因存在时,细胞利用甲醇能力正常,在甲醇培养基上生长较快,这种菌株表型被称为Mut+。AOX1基因的表达为转录水平调控。AOX1基因的调控是一个抑制机制加上诱导机制的过程,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录,而在以甲醇为唯一生长碳源时诱导基因转录,蛋白质表达。在一般情况下,胞内AOX酶的变化直接反映了外源蛋白的表达状况,因此通过分析检测胞内AOX酶的含量和变化速率,就可以确定外源基因所处的状态。
2.2 毕赤酵母表达系统的构成
2.2.1 表达载体
由于毕赤酵母内没有稳定的附加体质粒，表达载体主要是可以整合到酵母基因组中的整合型质粒，其主要元件包括：5′AOX1启动子、信号肽、供外源基因插入的多克隆位点、3′AOX1终止子、选择标志，以及可以诱导基因发生重组的同源序列和在大肠杆菌中的复制起点及抗药性基因。这是因为转化毕赤酵母的重组质粒是穿梭质粒,含有大肠杆菌的复制起始区,可在大肠杆菌中复制扩增。然而这类质粒不含有可在酵母中复制的复制子,只有重组表达载体整合入酵母基因组中后,重组质粒才能稳定存在。在大肠杆菌中大量扩增后的质粒,用特定的限制性内切酶在表达载体的标记基因或者启动子区切割(转化时,载体DNA必须切成线状才能与染色体进行同源重组),获得游离的末端。整合载体转化受体菌时,可以和染色体上的相应位点发生互换,将整个载体连同外源基因整合入酵母菌染色体。由于该表达系统插入的外源基因不是存在于自主复制的表达载体中,而是和表达载体一起整合到了酵母染色体上,随染色体一起复制和遗传,因此不会发生外源基因的丢失现象。目前,Invitrogene公司已开发出多种毕赤酵母表达载体,如：pPIC9、pHILD2、pHILS1及pPICZA、B、C系列和pPICZaA、B、C系列等适合于胞内分泌的表达载体。
2.2.2 宿主菌株
通过一种或两种AOX基因的删除,根据利用甲醇的能力,可把毕赤酵母宿主菌分为3种主要类型：①Mut+表型。多数菌株含有AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型(Mut+),如GS115,X-33是目前最常用的宿主菌。②MutS表型。当AOX1被其它基因如酿酒酵母的ARG4基因取代时,则需依赖AOX2，称为甲醇利用慢表型(MutS),如KM71。③Mut-表型。当AOX基因全部缺失,则不能利用甲醇,称为甲醇利用负表型(Mut-),如MC10023在以甲醇为碳源的培养基中不能生长。
2.3 抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达
根据抗菌肽的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好的密码子，设计合成抗菌肽新基因，克隆到表达载体中再转化入毕赤酵母中进行表达。现在一般多用两步法来诱导抗菌肽的表达，即表达菌株首先在以甘油为碳源的培养基中生长，细胞大量增加而抗菌肽表达受到抑制；当甘油耗尽时，加入甲醇来诱导抗菌肽表达。毕赤酵母表达系统不仅表达产物都分泌于培养液中，而且毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，十分有利于抗菌肽的纯化。赖玉平等(2004)将从人汗腺中发现的抗菌肽DCD-1L基因克隆到毕赤酵母载体pPIC9k中，并在毕赤酵母GS115中进行了表达。结果表明GS115系统所表达的DCD-1L在pH值5.5～7.4范围内具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性。申艳敏等（2008）在毕赤酵母中高效表达了人源抗菌肽LL-37，检测显示LL-37对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性。尹娜等（2008）采用毕赤酵母系统，成功地分泌表达了具有生物活性的抗菌肽CecropinD，并检测到CecropinD对大部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌作用。Jin等（2008）将抗菌肽CecropinAD克隆到毕赤酵母载体pPICZa-A中，将SalI线形化的重组质粒pPICZa-CAD通过电穿孔转化毕赤酵母GS115，经1.0%甲醇诱导96 h后成功表达了抗菌肽CecropinAD，并检测到其对真菌、革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌均有抑菌作用。
在上述研究中我们发现，在以毕赤酵母为宿主菌的抗菌肽基因工程中，多数研究都实现了目的蛋白的分泌表达，并且产物没有对工程菌产生明显的抑制作用，这表明某些抗菌肽对酵母的毒性较小，因而更适于在该系统中表达。当然，具体到某一种抗菌肽是否适合在酵母中表达，以什么样的策略来构建载体，还需根据其活性特点具体分析。
2.4 抗菌肽基因在毕赤酵母中表达的影响因素
抗菌肽基因其自身的性质就是影响表达水平的重要因素,mRNA 5'端非翻译区(5'-UTR)的核苷酸序列和长度影响基因的表达,由于毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30％以上),极少有外源蛋白能达到这么高的水平,AOX1基因的5'-UTR长为114 bp并富含A+U。因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA5'-UTR尽可能和AOX1 mRNA5'-UTR相似是必需的,最好是保持两者一致。由于A+T含量高的基因往往会提前终止而不能有效转录,因此对AT含量丰富的基因最好是重新设计序列。在毕赤酵母中已证实,当HIVgpl20中阻止转录的序列5'ATTATTTTATAAA变成5'TTTCTTCTACAAG后,过早终止现象不再出现。另外,设计合成基因时,在坚持所翻译的氨基酸不变的原则,可设计利用毕赤酵母偏爱的密码子,来获得高效表达外源蛋白的菌株。
对毕赤酵母表达系统来说，甲醇诱导的温度、方式、用量、诱导时间都会对抗菌肽的表达水平产生影响；毕赤酵母的最适生长温度在25~30 ℃。储卫华等(2006)实验表明，在28 ℃摇瓶发酵时，抗菌肽抑菌率最高,说明适当低温会提高抗菌肽的表达， 但温度过低(≤26 ℃)则影响菌体的生长，导致抑菌率降低。温度过高,如30 ℃发酵时,其抑菌率也有所下降。用两步法(先用甘油培养使细胞达到一定的浓度，再加甲醇诱导)和联合生长培养的方法(Growth-associated，在早期加入甲醇诱导)来诱导外源蛋白的表达都有成功的报道，现在一般用两步法来诱导外源蛋白的表达。以甲醇作为诱导剂不但可以诱导AOX启动子驱动外源蛋白的表达,也可以诱导蛋白酶的表达,因此甲醇添加量对外源蛋白的表达可以产生影响,一般添加量为0.5％~1％。诱导时间也是影响因素之一,诱导时间应该在150 h左右,外源基因的表达才能达到最高,而有些菌表达时需要诱导200 h以上,过短的时间(72 h)表达量很低,过长的时间外源蛋白的降解增加,因此寻求一个最佳产量时间比就特别重要。如果用两步法来诱导外源蛋白的表达,则诱导时的起始pH值可能是毕赤酵母高效表达重组蛋白的关键之一，通过改变诱导时的pH值，可使其表达量提高。由于毕赤酵母能忍耐较宽的pH值范围（pH值3.0～7.0），因此可调节溶液pH值抑制蛋白水解酶活性，防止目的蛋白降解。
3 小结
总之，各种表达系统各有优缺点，使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低；但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。毕赤酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力，但发酵周期较长，易污染，且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达；利用易燃的甲醇作原料，表达产物的卫生安全性需要考虑。因此，选择表达系统时，应充分考虑各种因素，如生产成本、表达水平、安全性、表达周期等。随着对外源基因表达系统研究的不断深入，通过基因克隆与表达而大量生产抗菌肽成为可能。但如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，真正实现规模化、产业化，还需要进行更多的探索和尝试。