泡菜汁中植物乳杆菌的分离鉴定

杜志琳 尹 望 陈春艳 

(北京好实沃生物技术有限公司,北京 101399)

摘 要: 为丰富植物乳杆菌菌种来源,研究从泡菜汁中分离获得3 株疑似植物乳杆菌的细菌,并分别对 其编号。通过形态特征、生理生化鉴定和16S rDNA 分子鉴定3 种方法鉴定分离获得的3 株细菌,结果表明, 分离获得的3 株菌均为植物乳杆菌,分别是植物乳杆菌HEW - Z106、植物乳杆菌HEW - Z111 和植物乳杆菌 HEW - Z117。 

关键词: 泡菜汁; 植物乳杆菌; 分离鉴定

益生菌作为一种新型绿色饲料添加剂,受到各 国研究者的重视,有着良好的发展前景。益生菌是 对宿主有益的一类活性微生物,作用于人及动物体 肠道和生殖系统等,可改善宿主肠道微生态平衡, 发挥有益作用。而乳酸菌作为一类应用广泛的益生 菌,是动物肠道中的优势菌群,其无毒、无残留及 无抗药性备受关注。植物乳杆菌是一种常见于发酵 肉类、蔬菜和果汁中的乳酸菌,是人和动物肠道内 的主要菌群,呈革兰阳性杆菌,不形成芽孢、无鞭 毛及不运动,过氧化氢酶试验呈阴性,能够产生细 菌素等抑菌物质,可抑制革兰阳性菌、革兰阴性菌 及真菌的生长,有研究表明饲喂植物乳杆菌可显著 地提高仔猪的饲料转化率 ( P <0. 05) ,并对其日增 质量略有提升,还可降低料重比; 饲喂植物乳杆菌能 够提高动物机体的免疫机能,调节肠道菌群的平衡, 从而达到抵抗感染性及过敏性疾病,确保动物健康生 长。随着人们对植物乳杆菌的认识的深入及现代生物 技术的飞速发展,新型的植物乳杆菌将会进一步发掘, 并将广泛应用于今后的食品、医药和饲料添加剂等领 域。研究通过从自制泡菜汁中分离获得植物乳杆菌, 并鉴定分离获得的菌株,旨在丰富植物乳杆菌菌种库,为植物乳杆菌的研究提供菌种来源。 

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 分离材料 自制泡菜汁作为分离菌种的材料。 1.1.2 菌种 植物乳杆菌购自中科院微生物菌种保藏中心, 作为生理生化鉴定中的模式菌株,在 MRS 培养基 上常规培养。 1.1.3 供试主要培养基和试剂 MRS 培养基,MRS + 碳酸钙培养基,LB 培养 基等; 十二烷基硫酸钠 ( SDS) 、三羟甲基氨基甲 烷 ( Tris) 碱和十六烷基三甲基溴化铵 ( CTAB) 等 细菌 DNA 提取的试剂为进口,16S rDNA PCR 扩展 引物 F: ( 5' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3') 和 R:( 5' - TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3') 由上海 生物工程有限公司合成。dNTP、TaqDNA 聚合酶等均 购自生物工程 ( 上海) 有限公司,其他试剂均为国产 分析纯试剂。 1.1.4 试验仪器 见表1。 1.2 方法 1.2.1 植物乳杆菌的分离纯化 取自制泡菜汁,用灭菌氯化钠注射液稀释到10 -4倍,取100 μL 涂布于 MRS + 碳酸钙培养基平 板上,37 ℃厌氧培养 24 ~ 48 h 后,采用四分区划 线法,挑取产生溶钙圈且菌落形态疑似植物乳杆菌 的菌落形态的菌株,在 MRS 培养基平板上进行分 离纯化培养,经24 ~48 h 培养后,挑取分离效果较 好的菌株,用接种环接种于斜面上 ( MRS) 进行纯 培养,于4 ℃冰箱保存备用。

表1 主要仪器设备 


仪器                              公司 


       JA2003 型电子天平                    上海舜宇恒平科学仪器有限公司 

           PB -10 型数字酸度计                    德国赛多利斯科学仪器 ( 北 京) 有限公司

HZC -250 型恒温振荡培养箱                     江苏省太仓市实验设备厂 

LDZH -200KBS 型立式压力蒸汽灭菌器                上海申安医疗器械厂 

T -42K 型高速冷冻离心机                      德国 KONTRON 公司

       MG48 +型 PCR 仪                          杭州朗基科学仪器有限公司 

 GelDoc -It 200 型自动凝胶图像分析系统                 Ultra -Violet ProductsLtd 公司 


1.2.2 生理生化鉴定 参照东秀珠的 《常见细菌系统鉴定手册》和第 八版 《伯杰系统鉴定手册》中的植物乳杆菌的生理 生化鉴定的试验要求进行鉴定。 1.2.3 16S rDNA 分子鉴定 通过生理生化试验初步筛选出的植物乳杆菌进 行基因组 DNA 鉴定,DNA 提取法参照姜云等的方 法,采用改良 CTAB 法提取。通过引物 F 及 R 对疑 似植物乳杆菌的16S rDNA 基因片段进行PCR 扩增, PCR 扩增体系 ( 25 μL) 及反应条件见表2,电泳 检测 PCR 产物质量,并回收纯化 PCR 产物,在中 科院微生物所测定疑似植物乳杆菌 DNA 序列。将 所得序列与 GenBank 中的 16S rDNA 序列进行 BLAST 比对,获得相似的序列与系统发育相关的物 种,用 MEGA 4. 0 软件构建系统发育树进行系统发 育分析。 

表2 植物乳杆菌的 PCR 扩增体系 (25 μL) 及反应条件 


PCR 扩增体系 ( 25 μL)                       反应条件 


    引物 F     1.0μL                     94 ℃预变性 5 min 

  引物 R    1.0μL                     94 ℃变性 40 s 

  Taq DNA 聚合酶   1.5U                    53 ℃退火 1 min 

   10 × Taq buffer  2.5μL                    72 ℃延伸 1 min 30 s 

Mg2 + ( 25 mmoL/L) 1. 5 μL                      共30 个循环 

       菌株基因组 DNA 50 ng                        72 ℃温浴 10 min  


2 结果与分析 2.1 细菌的初步分离观察 通过 MRS +碳酸钙培养基对泡菜汁进行细菌分 离,共获得3 株疑似植物乳杆菌的菌株,并将这3 株 菌分别编号为 HEW - Z106、HEW - Z111 和 HEW -Z117。以上3 株细菌在 MRS 培养基上用牙签挑起 可形成黏液状拉丝,革兰阳性,无芽孢、荚膜及鞭 毛,菌体有细长弯曲杆状,排列无序,也有对生, 两端顿圆,棒形球杆状。菌株的培养特征及菌体特 性见表 3。从图 1 可见: HEW - Z117 在加钙 MRS 培养基上,单个菌落能形成4 ~10 mm 溶钙圈。 

表3 菌株培养特性、菌体特征及菌株菌落特征


菌落                  菌落特征                  菌体特性 


        HEW - Z106 乳白色,表面凸起,圆形, 边缘整齐,表面光滑且湿润     革兰阳性,短杆状,排列 无序

        HEW - Z111 乳白色,表面微凸起,小圆 形,边缘整齐且光滑,湿润      革兰阳性,短杆状,成对 排列

            HEW - Z117 乳白色,呈凸透镜状,表面隆起,圆形,边缘整齐,湿润,   革兰阳性,棒球形杆状,成对排列

                     有光泽,光滑



注: A 为 HEW - Z117 在 MRS +碳酸钙培养基上生长的单菌落形 态,B 为其革兰染色形态 

图1 HEW - Z117 菌落形态及显微形态 

2.2 生理生化鉴定结果 分离获得的3 株细菌生理生化鉴定结果见表4, 3 株菌均可以在10 和 45 ℃下生长且氧化酶试验为 阳性,精氨酸双水解酶为阴性; 其他反应见表 4, 通过与植物乳杆菌模式菌株比较可初步鉴定 HEW - Z106、HEW -Z111 和 HEW -Z117 为植物乳杆菌。 

表4 分离菌的主要生理生化特征


2.3 16S rDNA 分子鉴定结果 通过 CTAB 法提取获得菌株 HEW - Z106、 HEW - Z111 和 HEW - Z117 的基因组 DNA,然后 分别对 HEW - Z106、HEW - Z111 和 HEW - Z117 的16S rDNA 进行 PCR 扩增,结果表明,通过 PCR 扩增获得了菌株 HEW - A106、HEW - A111 和 HEW - A117 的 16S rDNA 片段,片段大小均在 1 500 bp左右,见图2,对获得的 16S rDNA PCR 产 物进行测序,获得菌株 HEW - A106、HEW - A111 和 HEW - A117 的 16S rDNA 序列,大小分别为 1 425、1 467 和1 434 bp。用 MEGA4. 0 构建系统进 化树,从图 3 可见: 菌株HEW - Z106、HEW - Z111 和 HEW - Z117 均与植物乳杆菌聚于同一分 支,同源性均达到了99%。通过菌株 HEW - Z106、 HEW - Z111 和 HEW - Z117 的形态特征、生理生化 反应及 16S rDNA 特征,鉴定菌株 HEW - Z106、 HEW - Z111 和 HEW - Z117 均为植物乳杆菌。


注: M 为 DL2 000 ladder; 1 为植物乳杆菌模式菌株; 2 为 HEW - Z106; 3 为 HEW - Z111。

图2 16S rDNA 基因 PCR 扩增电泳结果

图3 植物乳杆菌和其他参考株16S rDNA 序列的系统进化树 

3 讨论 动物肠道是消化道中重要的吸收场所,也是其最大的免疫器官。肠道中存在大量的微生物菌群。 他们协同作用,防止外源病原菌突破这道屏障,以 达到维护机体健康的效果。植物乳杆菌是动物肠道 菌群的一种共生菌,能够产生乳酸菌素,可有效抑 制消化道中的病原菌 ( 大肠杆菌和沙门菌) 的生 长,维持动物肠道的微生态平衡,从而达到防治疾 病的效果,不但解决了抗生素使用所产生的残留问 题,而且能够提高动物饲料转化率。研究通过选择 培养基从泡菜汁中分离获得了 3 株疑似植物乳杆菌 的菌株,通过形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA 分子鉴定发现,3 株菌均为植物乳杆菌,即 HEW - Z106、HEW - Z111 和 HEW - Z117。研究获 得的植物乳杆菌通过发酵生产并处理加工后,作为 饲料添加剂应用于动物,无害、无污染且安全。 目前,国内外对植物乳杆菌的研究已经广泛开 展,并取得了一定的成效,欧盟及其他国家也已将 植物乳杆菌作为饲料添加剂中微生态制剂菌种的一 种。我国是植物乳杆菌等乳酸菌资源比较丰富的国 家,对其进一步研究起步较晚。近年来,植物乳杆 菌已经引起众多研究人员对乳酸菌、益生素、食品 添加剂、饲料添加剂及新药品开发等的研究。植物 乳杆菌不仅能够使动物肠道环境偏酸,不利于病原 菌生长,而且能够产生抑菌物质,抑制病原菌的侵 入。研究仅对分离获得的菌种进行了鉴定,将对其 他益生性能做进一步研究,将深入探讨这 3 株植物 乳杆菌的益生性,及其在动物微生态制剂中的应用 效果,仍需要动物饲养试验才能确定。

参考文献:

[1]杨雪海,赵娜,魏金涛, 等. 植物乳杆菌对致病性大肠 杆菌的抑制效果研究[J] . 饲料研究, 2011(1): 27 - 28. 

[2]侯成立,季海峰,周雨霞,等. 植物乳杆菌对断奶仔 猪生产性能和生化指标的影响[J] . 饲料研究, 2011(12) :14 -16. [3]曲冬梅,刘小杰. 植物乳杆菌及其在食品工业中的 应用[J] . 中国食品添加剂, 2008(S1) :219 -222. 

[4]肖仔君,钟瑞敏,陈惠音,等. 植物乳杆菌的生理功 能与应用[J] . 中国食品添加剂, 2005(2):87 -89.

[5] Dacachel M A. Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives[J] . Food Technol. , 1989(43) :164.

[6]王海宽,陈冲,王应东,等. 以食品级原料进行植物 乳杆菌发酵及其抗真菌活性的研究[J] . 天津科技 大学学报, 2014, 29(2):1 -5. 

[7]马妙莲,赵静,陈晓琳,等. 具有广谱抑菌活性乳酸 菌的筛选及抑菌物质分析[ J] . 食品科学, 2012, 33 (1):162 -165. 

[8]周盟. 植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌及其复合菌在 断奶仔猪和犊牛日粮中的应用研究[D] . 乌鲁木 齐:新疆农业大学, 2013. 

[9]Ariel L. Rivas and Julius Fabricant. Indications of immunodepression in chickens infected with varians strains of Marek's disease virus[J] . Avian Disease, 1988(32) :1 -8. 

[10]杭柏林,胡建和,刘丽艳,等. 乳酸菌株植物乳杆 菌和粪链球菌对肉鸡免疫性能的影响[J] . 广东 农业科学, 2008(11) :80 -83.

[11]Ade Moreno de LeBlanc, Chaves S, Carmuega E, et al. Effect of long - term continuous consumption of fermented milk containing probiotic bacteria on mucosal immunity and the activity of peritoneal macrophages[J] . Immunobiology, 2008(213) : 97 - 108. 

[12]石峰,王涛,牛钟相. 乳酸菌微生态制剂对肉鸡生产性能及免疫机能的影响[J] . 山东农业大学 学报:自然科学版, 2011, 42(1):79 —83

[13]于志会,刘志强. 植物乳杆菌在食品工业中的应 用[J] . 吉林农业科技学院学报, 2012, 21(3):32 - 34.

[14]东秀珠,蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M] . 北 京:科学出版社, 2001. 

[15]姜云,尹望,陈长卿,等. 人参内生可培养细菌 16S rDNA - RFLP 分析[ J] . 东北林业大学学报, 2012, 40(8):34 -39. 

[16]Botina S G, Sukhodolets V V. Speciation in bacteria: Comparison of the 16S rRNA gene for closely rela - ted Enterococcus species[J] . Russian Journal of Genetics, 2006, 42(3):247 -251. 

[17]董懿樱,陈臣,任婧,等. 乳酸菌对肠免疫调节功 能研究进展[J] . 中国微生态学杂志, 2014, 26 (2):221 -224, 242. 

[18]王蔚淼,张家学,齐振雄. 乳酸菌类微生态制剂 在饲料中的应用[J] . 饲料博览: 技术版, 2008 (7):8 -11.




2018年6月8日 14:48
浏览量:0
收藏
本网站由阿里云提供云计算及安全服务 Powered by CloudDream