一株乳酸菌培养条件优化及对 胆盐和酸性环境耐受性的研究

尹望  杜志琳  李雪平 

(北京好实沃生物技术有限公司,北京 101399)

摘 要:对一株猪源乳酸菌 HEW - A208 的培养条件进行优化,并研究其对胆盐及酸性环境的耐受性。 通过对菌落数、菌落大小和溶钙圈大小3 项指标进行检测,确定乳酸菌分离培养基为最优培养基; 在 pH 2. 5、3. 5 和4. 5 环境下处理150 min 对该菌无显著影响,在 pH 1. 5 环境下处理 30 min 该菌仍保持较高的存 活率; 胆盐对该菌生长有一定影响,但短时间内低质量分数处理影响较小。相同胆盐质量分数下,培养时间 越长,活菌数越低,胆盐质量分数高于0. 2%时该菌生长基本停滞。 

关键词:乳酸菌; 猪源; 培养条件优化; 酸性环境; 胆盐

  乳酸菌是一群广泛存在于人畜肠道、禽肠道、 食品、物料及少数临床样品中,能够分解糖产生大 量乳酸的革兰阳性细菌的统称。目前,乳酸菌已被 广泛应用于食品、畜牧和工业等各个领域,其特殊 的生理活性和营养功能正日益引起人们的重视。乳 酸菌可以提高食品的营养价值,改善食品风味,提 高食品保藏性和附加值; 也可以用于饲料添加剂的 生产,乳酸菌能够调节畜禽肠道内正常菌群和保持 微生态平衡,提高饲料转化率,降低料肉比,同时 也提高了畜禽的抗病能力从而降低抗生素的用量; 乳酸菌用于微生态制剂,必须提高其对耐酸和耐胆 盐的能力,HEW - A208 是从猪肠道中分离的乳酸 菌中产酸能力及抑菌能力最强的一株菌,研究该菌 对低 pH 和胆盐的耐受性,旨在为猪源乳酸菌应用 于饲料添加剂提供理论依据。 

1 材料与方法 

1.1 菌株 

  北京好实沃生物技术有限公司实验室保藏的一 株筛选自仔猪肠道的乳酸菌,在 MRS 培养基上常规培养。 

1.2 供试主要培养基和试剂 

   RJP 培养基: 牛肉膏 3、蛋白胨 3、酵母菌 3、 乳糖20 和琼脂15 g/L,pH 6. 0。 

   MRS 固体培养基: 牛肉膏 10、酵母膏 5、葡萄 糖 20、无水乙酸钠 5、柠檬酸氢二铵 2、MnSO4· H2O 0. 05、K2HPO4 2、MgSO4·7H2O 0. 2 和琼脂粉 18 g/L,吐温80 1 mL/L,pH 6. 8。 

    LAB 培养基 : 购自太鼎生物科技有限公司。 

    乳酸菌分离培养基: 牛肉膏10、蛋白胨10、酵 母膏10、葡萄糖10、CaCO3 20 和琼脂15 g/L,番茄汁 20%、吐温80 0. 05%和溴甲酚绿0. 01%,pH 6. 5。 

   改良马铃薯培养基: 马铃薯 200、蔗糖 2 和琼 脂20 g,pH 自然 ( 约6. 0) 马铃薯去皮,切成块加 水,煮沸30 min,用纱布过滤,滤液加糖,定容至 1 000 mL,装入三角瓶。 

   LB 固体培养基 ( f) : 蛋白胨10、酵母粉5、氯 化钠10 和琼脂 10 g/L,猪胆盐 ( 购至上海化学试 剂公司,含胆酸60%以上) ,盐酸,氯化钠注射液。 

1.3 主要试验仪器 

  JA2003 型电子天平 ( 上海舜宇恒平科学仪器 有限公司) ,HZC -250 型恒温振荡培养箱 ( 江苏省太仓市试验设备厂) ,LDZH - 200KBS 型立式压力 蒸汽灭菌器 ( 上海申安医疗器械厂) 等。 

1.4 方法 

1.4.1 乳酸菌 A208 生长曲线绘制 

   将活化多次的 HEW - A208 以5% ( 体积/体积) 的接种量接入 MRS 液体培养基,瓶口用10 层纱布加 牛皮纸包住,置于恒温摇床,180 r/min,37 ℃条件 下培养。0 ~18 h,每隔1 h 取一次样,0 h 的样作为 对照,于600 nm 处比色,测定发酵液的 OD 值。 

1.4.2 乳酸菌 HEW - A208 培养条件优化 

   取 HEW - A208 沙土管保藏的菌种经平板和斜 面多次活化,取菌液1 mL,用 0. 9%氯化钠溶液进 行梯度稀释,取10 -6、10 -7和 10 -83 种稀释度,分 别接种于 6 种培养基中,取 1 mL 不同稀释度的菌 液,用倾注法与培养基混合均匀,培养基凝固后置 于37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h,进行菌落计 数。每天1 次,并用刻度尺在放大镜下测量菌落及 溶钙圈的直径。 

1.4.3 乳酸菌 A208 胆盐耐受性检测 

   试验选用 4 个胆盐质量分数处理,0. 1%、 0. 2%、0. 3%和0. 4% ( 质量/体积) ,不加胆盐组 作为对照组。将活化好的乳酸菌 A208 按 5% ( 体 积/体积) 的接种量接种于上述各试验组,培养基 选用液体 MRS 培养基,37 ℃恒温摇床180 r/min 培 养。于接种后的 1、2、3、4 和 5 h 取样测定活菌 数,平板计数采用固体 MRS 培养基倾注法,37 ℃ 常规培养。 

1.4.4 乳酸菌 A208 低 pH 耐受性检测 

   试验选用4 个不同 pH 处理,用1 mol/L 盐酸调 节 MRS 液体培养基至 pH 1. 5、2. 5、3. 5 和4. 5,接 种量、接种方法与培养方法同上。于接种后的 0、 30、60、90、120 和150 min 取样测定活菌数,平板 计数采用固体 MRS 培养基倾注法,37 ℃常规培养。 

2 结果与分析 

2.1 乳酸菌 A208 的生长特性测定 

  从图1可见: A208在接种后1 ~ 2 h生长较缓慢,3 h 后进入对数生长期,8 h 后 OD 值趋于稳 定,进入稳定期。 


图1 乳酸菌 A208 生长曲线

2.2 乳酸菌 A208 培养条件优化结果 

   从表1 可见: 在这6种常见培养基中,乳酸菌 A208 在乳酸菌分离培养基中生长最佳。第4天的 活菌数达 4.41 亿 CFU/mL,菌落直径达 0.48 cm, 溶钙圈直径1.11 cm。A208 生长最差的是 LAB 培养 基,第6天活菌数仅为 0.449 亿 CFU/mL,菌落直 径为0.12 cm。 

表1 不同培养基中 A208 的生长情况



2.3 不同 pH 环境对乳酸菌 A208 生长的影响 

   从表2 可见: pH 2. 5、3. 5 和4. 5 对 A208 的生 长无太大影响,在 pH 4. 5 时,活菌数随时间的延 长而不断上升,菌株生长良好; 在 pH 3. 5 时,整 个处理时间段内,活菌数基本保持不变,说明 pH 3. 5 和4. 5 对 A208 的存活无明显抑制作用; 在 pH 2. 5 时,随时间延长,活菌数有所下降,但最后活 菌数仍然较高; 在 pH 1. 5 时,处理时间到 60 min 以上时,活菌数低于 1 万 CFU/mL,说明 A208 对 pH 1. 5 的耐受性差。

表2 不同 pH 环境对乳酸菌 A208 的生长影响 CFU/mL 


2.4 胆盐对乳酸菌 A208 存活的影响 

   从表3 可见: 与对照相比,总体上 A208 的生 长受到胆盐的抑制,随着培养时间的延长,活菌数 下降,且在处理时间相同的条件下,胆盐质量分数 越高,A208 活菌数越低。其中,A208 对 0. 1% 胆 盐耐受性最强,在 0. 2% 和 0. 3% 胆盐质量分数条 件下,耐受性较差; 0. 4%胆盐质量分数下 A208 生 长更差。

表3 不同胆盐质量浓度下 A208 的活菌数 CFU/mL


3 讨论与结论 

   研究通过比较 A208 在不同固体培养基中的生 长情况,筛选出了最适合其生长的固体培养基,即 乳酸菌分离培养基。 

   益生菌是以口服的方式进入动物消化道内,因 此必须保证所选用的菌株具有抵抗较低 pH 的能力, 才能有效的发挥作用。乳酸菌是肠道中常见的内源 性细菌,畜禽食用乳酸菌后,可以改变肠道内环境, 抑制有害菌的繁殖,调节肠道菌群平衡。乳酸菌通 过黏菌素与肠黏膜细胞紧密结合,能够修复肠道菌 群屏障,防治肠道疾病。作为益生菌中常用的菌种, 乳酸菌代谢过程中本身产乳酸,可适应较低的 pH 环 境,一般都能够抵抗较低 pH 环境。试验室筛选的 A208 能够耐受 pH 1. 5 的酸性环境,且存活率较高。 仔猪出生时胃液pH 在5 ~6,数小时后会降到4 左右, 2 月龄后在3 以下,成年猪的最低 pH 可达到1. 5。因 此,A208 的耐酸能力达到了要求。 

   作为益生菌,除了具备上述耐受低 pH 环境的 能力外,还必须能够耐受小肠中胆盐等形成的高渗 透压环境。目前,一些乳酸菌具备一定的胆盐耐受 能力。实验室筛选的乳酸菌 A208 在 0. 1 % 胆盐质 量分数下存活率相当可观。 

   益生菌除了能耐受酸性环境和高质量分数胆盐的能力外,还需具备在肠道中快速繁殖的能力。生 长速度快的益生菌株能够成为肠道中的优势菌群, 能够发挥其益生作用。因此,研究 A208 的生长曲 线,发现其在 3 h 后迅速进入对数生长期,在 8 ~ 10 h 左右菌量达到最高,说明它具有在肠道中快速 繁殖的能力。 

   综上所述,乳酸菌 A208 具有生长繁殖速度快, 耐受较低 pH 和胆盐环境的能力,是一株优良的菌 株,有进一步研究的价值。

参考文献

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2018年6月8日 14:43
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