一株猪源粪肠球菌 DT －02 的培养基优化
尹望 杜志琳 李雪平
（北京好实沃生物技术有限公司，北京 101399）
摘 要：在成功筛选到一株猪源粪肠球菌 DT －02 后，首先在 MＲS 培养基的基础上对该菌进行培养基优 化。先进行单因素优化，后进行正交设计试验，最终得的最优培养基组合为葡萄糖3. 0%、蛋白胨 3. 0%、 MnSO4·H2O 0. 07 g/L、酵母粉1%、无水乙酸钠1. 4%、柠檬酸氢二铵0. 5%、MgSO4·7H2O 0. 2%、K2HPO4 0. 2%和吐温 －80 0. 4%。优化后的 MＲS 培养基使摇瓶发酵活菌数提升了58. 79%。
关键词：粪肠球菌; 培养基优化; 单因素优化; 正交设计
肠球菌属是人和恒温脊椎动物肠道内的革兰阳 性菌，有着非常重要的医学意义。肠球菌广泛存在 于各种乳制品和发酵食品中，不仅能够影响食品的 风味和质地，还能产生乳酸、有机酸、乙醇、过氧 化氢、双乙酰和细菌素等许多抑菌物质。如一些肠 球菌素具有广谱抗菌作用。粪肠球菌作为肠球菌属 最常见的一种，现已作为益生菌和发酵剂广泛用于 微生态制剂、保健食品及发酵食品的工业生产中。 文章通过单因素优化及正交设计对一株猪源粪肠球 菌进行了培养基优化，为该菌应用于微生态制剂提 供理论基础。
1 材料与方法
1.1 菌种
DT －02，由北京好实沃生物技术有限公司试验 室保藏的一株筛选自仔猪肠道的粪肠球菌，在常规 MＲS 培养基上培养。
1.2 培养基
种子培养基: 牛肉膏10、酵母粉5、蛋白胨10、 葡萄糖5、柠檬酸氢二铵 2、无水乙酸钠 5、K2HPO4 2、MnSO4·H2O 0. 05 和 MgSO4·7H2O 0. 2 g/L 及吐温 －80 1 ml/L，pH 6. 8。
MＲS 固体培养基: 牛肉膏 10、酵母膏 5、葡萄 糖 20、无水乙酸钠 5、柠檬酸氢二铵 2、MnSO4 · H2O 0. 05、K2HPO4 2、MgSO4·7H2O 0. 2 和琼脂粉 18 g/L，吐温 －80 1 ml/L，pH 6. 8。
MＲS 液体培养基: 牛肉膏 10、酵母粉 5、葡萄 糖 20、无水乙酸钠 5、柠檬酸氢二铵 2、K2 HPO4 2、MnSO4 ·H2 O 0. 05 和 MgSO4 ·7H2 O 0. 2 g/L， 吐温 －80 1 ml/L，pH 6. 8。
1.3 生长曲线的绘制
取粪肠球菌 DT － 02 于 MＲS 平板上活化两代， 活化完成后于MＲS 斜面划线，37 ℃培养24 h。取2 管斜面，分别用 2 mL 0. 9% 氯化钠溶液将菌苔洗 脱。取1 mL 菌液接种于液体 MＲS 培养基，摇匀， 取0 h 的样品后于 37 ℃，180 r/min 条件下恒温摇 瓶培养16 h。每1 h 取一次样并立即进行活菌计数， 计数方法采用固体 MＲS 倾注法。
1.4 培养基优化
1.4.1 碳源及其添加量的选择
选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜和可溶性淀粉 作为碳源，以2%的添加量取代 MＲS 培养基中的碳 源。37 ℃，180 r/min，培养16 h 后进行活菌计数， 计数方法采用固体 MＲS 倾注法。最佳碳源选定后，按照1. 0%、2. 0%、3. 0%、4. 0% 和 5. 0% 的添加 量加入到 MＲS 培养基中，培养 16 h 后进行活菌 计数。
1.4.2 氮源及其添加量的筛选
选择硝酸铵、硝酸钠、尿素、硫酸铵、硝酸 钾、氯化铵、牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏和蛋白胨组 合 ( 1∶1) 取代 MＲS 中的氮源，添加量按照 MＲS 培 养基中氮含量及以上各种氮源含氮量来折算。37 ℃， 180 r/min 条件下培养16 h 后进行活菌计数。
1.4.3 无机盐和生长因子及其添加量的筛选
确定最优碳源和氮源后，以最优碳源和氮源作 为培养基的碳源和氮源，将 MＲS 中的无水乙酸钠、 柠檬酸氢二铵、K2 HPO4、MnSO4 ·H2 O、MgSO4 · 7H2O 和吐温 － 80 分别单独加入培养基中，通过测 定16 h 活菌数得出各种无机盐及生长因子对粪肠球 菌生长的相关性。根据各种无机盐和生长因子对粪 肠球菌生长影响的大小，对其添加量进行筛选。
1.5 正交试验
在单因素试验的基础上，确定了碳源、氮源及 无机盐中 MnSO4对 DT － 02 生长影响较大，因此正 交设计选取葡萄糖、蛋白胨和 MnSO43 个因素，进 行3 因素3 水平正交试验设计。
1.6 统计分析
用Excel 将不同培养基成分对DT －02 的活菌数 的影响进行整理与分析。
2 结果与分析
2.1 粪肠球菌 DT －02 生长曲线的绘制
从图1 可见: 粪肠球菌的生物量在1 ～2 h 没有 明显的变化，pH 保持在 6. 8 左右，此时粪肠球菌 处在迟缓期。2 ～7 h，菌体呈对数增长趋势，8 h 以 后生长缓慢，10 h 后进入稳定期，活菌数基本稳 定。17 h 后活菌数略有下降，可能是由于一部分菌 体开始自溶。pH 的变化曲线与粪肠球菌的生长曲线基本吻合，是由于粪肠球菌在生长过程中不断产生乳 酸所致，所以对数期内 pH 急剧下降。随着培养时 间的延长，pH 下降幅度逐渐减小，10 h 后 pH 基本 保持不变。粪肠球菌在培养过程中不断受到自身发 酵产物———乳酸的抑制，因此 pH 的下降幅度会逐 渐减小。
图1 粪肠球菌 DT －02 生长曲线和 pH 变化曲线
2.2 不同碳源对粪肠球菌活菌数的影响
从图2 可见: 粪肠球菌的最佳碳源为葡萄糖， 其次为乳糖和蔗糖，再次为糖蜜。淀粉不能被粪肠 球菌很好的利用，淀粉是多糖，可能是因为乳酸菌 在生长过程中缺少淀粉酶，不能把淀粉水解为单 糖，因此对淀粉的利用效率极低。而葡萄糖作为碳 源对粪肠球菌的生长促进效果最为明显，因为葡萄 糖是单糖，属于速效利用碳源，能够被粪肠球菌直 接利用，迅速提高其生物量。
图2 不同碳源对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.3 葡萄糖的最佳添加量筛选
从图3 可见: 随着葡萄糖添加量的加大，粪肠 球菌的生物量在一定范围内也逐渐增大，当添加 量达到 3. 0%时，活菌数最高; 超过 3. 0% 再增加 葡萄糖的量，活菌数不但不增加，反而呈下降趋 势，可能是因为糖质量浓度过高导致渗透压较高， 菌体生长受到抑制。因此，葡萄糖的最佳添加量 为3. 0%。
图3 葡萄糖添加量对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.4 不同氮源对粪肠球菌活菌数的影响 从图4 可见: 粪肠球菌对无机氮源的利用率较 低，能够有效促进其生长的是牛肉膏和蛋白胨，属 于有机氮源。这是因为粪肠球菌合成蛋白的能力较差，不易利用无机氮源，而有机氮源中含有丰富的 氨基酸，较容易被吸收利用。单独使用蛋白胨和混 合牛肉膏使用效果相近，且牛肉膏的成本较高，因 此为降低生产成本，选用蛋白胨作为粪肠球菌的 氮源。
图4 不同氮源对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.5 蛋白胨的最佳添加量筛选
从图 5 可见: 确定最佳氮源后，选取蛋白胨 的添加量分别为 1. 0% 、2. 0% 、3. 0% 、4. 0% 和 5. 0%，培养 14 h 后，进行活菌计数。粪肠球菌 的生物量随着蛋白胨的添加量的增加而上升，到 3. 0% 处出现拐点，因此蛋白胨的最佳添加量 为 3. 0% 。
图5 蛋白胨添加量对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.6 不同无机盐和生长因子对粪肠球菌活菌数的影响
从图6 可见: 以葡萄糖和蛋白胨作为基础培养 基，分别向其中单独加入无水乙酸钠、柠檬酸二 铵、K2HPO4、吐温 －80、MnSO4·H2O 和 MgSO4· 7 H2O 进行试验，以不加无机盐和生长因子的基础 培养基作为对照组。添加无水乙酸钠、柠檬酸二铵、吐温 －80 和 MnSO4·H2O 对粪肠球菌的生长有 促进作用。其中，MnSO4 ·H2 O 的促进作用最明 显，其次为无水乙酸钠。而 K2HPO4 和 MgSO4 ·7 H2O 对粪肠球菌生长的促进作用不明显。
图6 不同无机盐对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.6.1 MnSO4·H2O 添加量的筛选
从图7 可见: 以葡萄糖和蛋白胨为基础培养基， 向其中分别加入 0. 05、0. 10、0. 15、0. 20、0. 25 和 0. 30 g/L 的MnSO4·H2O，以不加MnSO4·H2O 的基 础培养基作对照。基础培养基中加入0. 05 g/L 的 MnSO4·H2O 能够明显提高粪肠球菌的生物量，超 过1. 0 g/L 后促进用略有降低。因此，MnSO4·H2O 的最佳添加量为0. 05 g/L。
图7 MnSO4·H2O 添加量对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.6.2 无水乙酸钠添加量的筛选
从图8 可见: 以葡萄糖、蛋白胨和 MnSO4·H2O ( 0. 05 g/L) 作为基础培养基，分别加入 0. 2%、 0. 4%、0. 8%、1. 0%、1. 2%、1. 4%和 1. 6%的无 水乙酸钠，以不添加无水乙酸钠的基础培养基作对 照。培养基中加入少量无水乙酸钠可以提高粪肠球 菌的生物量，随着无水乙酸钠的添加量的增加，粪 肠球菌的生物量逐渐增高，在 1. 4% 处出现拐点， 因此无水乙酸钠的最佳添加量为1. 4%。
图8 无水乙酸钠添加量对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.6.3 柠檬酸氢二铵添加量的筛选
从图9 可见: 以葡萄糖、蛋白胨、MnSO4·H2O ( 0. 05 g/L) 和无水乙酸钠 ( 1. 4%) 为基础培养 基，分别向其中加入 0. 1%、0. 2%、0. 3%、 0. 4%、0. 5%、0. 6%和0. 7%的柠檬酸氢二铵。柠 檬酸氢二铵的质量浓度在 0. 5% 以下时，粪肠球菌的生物量随柠檬酸二铵添加量的增加而增加，超过 0. 5%时，粪肠球菌的生物量会逐渐下降。可能是 因为柠檬酸氢二铵对粪肠球菌的糖代谢途径的关键 酶———磷酸果糖激酶有调节作用，柠檬酸对磷酸果 糖激酶有抑制作用，而适当质量浓度的铵根离子 ( NH4 + ) 可以解除这种抑制作用。因此，柠檬酸二 铵的最佳添加量为0. 5%。
图9 柠檬酸氢二铵添加量对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.6.4 吐温 －80 添加量的筛选
从图10 可见: 吐温 － 80 是聚氧乙烯脱水山梨 醇单油酸酯，简称聚山梨酯 － 80，通常作为乳化剂 和分散剂，一方面能够使培养基中的营养成分更加 均匀，另一方面它是一种刺激因子，能够在一定程 度上促进乳酸菌的生长。吐温 － 80 的最佳添加量 是0. 40%。
图11 酵母浸粉添加量对粪肠球菌 DT －02 活菌数的影响
2.8 正交试验 正交设计表见表1，试验结果见表2。
表1 正交设计表
表2 正交设计试验结果
从表2 可见: 通过 3 种因素的 Ｒ 值来看，3 种 影响因素对粪肠球菌活菌数的影响大小排序为 A ＞ B ＞ C。根据 k 值可以确定，最佳组合为 A2 B2 C3， 即葡萄糖、蛋白胨和 MnSO4 ·H2 O 的添加量分别为 3. 0%、3. 0%和0. 07 g/L。
因此，最优培养基组合为葡萄糖3. 0%、蛋白 胨3. 0%、MnSO4 ·H2 O 0. 07 g/L、酵母粉 1. 0%、 无水乙酸钠 1. 4%、柠檬酸氢二铵0. 5%、MgSO4· 7H2O 0. 2%、K2HPO4 0. 2%和吐温 －80 0. 4%。
使用优化后的培养基再次进行粪肠球菌 DT － 02 的生长曲线测定，结果如图 12 所示。在优化后 的培养基中，菌体在对数期繁殖更
迅速，16 h 的活菌数为 16. 99 亿 CFU/mL，与初始 的 MＲS 培养基相比提高了58. 79%。
图12 2 种不同培养基中粪肠球菌 DT －02 的生长曲线
3 讨论与结论
粪肠球菌是链球菌科肠球菌属的一种，是人类 和动物肠道中正常菌群的一部分，广泛分布于自然 界中。利用无毒害及兼性厌氧菌的粪肠球菌配合枯 草芽孢杆菌和酵母菌等益生菌制成微生态制剂 ( AMEA) ，可调节动物肠道平衡，减少多种消化道 疾病的发病率，有望代替抗生素的使用。
研究对一株猪源粪肠球菌 DT － 02 进行了培养 基优化，提高了摇瓶发酵活菌数，为提高发酵生产 效率，降低生产成本提供了一些理论基础。
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