一株鸡源屎肠球菌的 分离及鉴定

杜志琳  尹望  张艳萍  李雪平 

(北京好实沃生物技术有限公司,北京 101399)


摘 要:为丰富可用作禽用微生态制剂的肠道益生菌株,研究选择 7 日龄健康雏鸡肠道内容物,利用 KF 链球菌琼脂培养基分离培养目标分离菌株,通过形态特征和培养特性、生理生化及 16S rDNA 分子鉴定 法,最终确定1 株分离菌为屎肠球菌,命名为 HEW - A527,为后续禽类益生菌的益生功能及微生态制剂研 究提供理论依据。 

关键词:屎肠球菌; 益生菌; 鉴定

  益生菌是对宿主有益的一类活性微生物,主要 定植在动物肠道和生殖系统内,可产生对宿主有益 的活性物质,从而改善宿主的微生态平衡,发挥有 益作用。肠球菌是广泛存在于动物和人体消化道内 的一类益生菌,对肠道酸性环境有较强的耐受力, 并对肠黏膜的定植能力强,进而保证充分发挥其益 生性能。国内外研究表明,益生菌能够促进消化, 改善肠道菌群,提高免疫力,抵抗癌症等功效。常 见的益生菌有乳杆菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌和 酵母菌等,肠球菌也同样具有相关功能。与严格厌 氧培养保存条件苛刻的双歧杆菌相比,肠球菌具有 兼性厌氧的生理特性,更适用于生产和应用。 

   近年来,益生菌剂越来越受到人们的重视,具 有绿色、安全、无毒及无残留的优点。2008 年,我 国农业部就公告了允许使用的微生物饲料添加剂, 屎肠球菌就包括在内。有研究表明: 从鸡肠道分离 的屎肠球菌具有良好的产乳酸性能,且稳定期活菌 数高,还可产生细菌素,结合其他代谢产物对常见 的动物致病菌有显著的抑制作用。优良的益生菌大 多来自动物体内,不仅能够耐受胃肠道环境,而且 生长快,可产酸和抑菌物质,抑制致病菌的繁殖并定植在肠道内。 试验从7 日龄健康雏鸡肠道内容物中分离出1 株肠球菌,经形态学、生理生化和分子生物学鉴定 为一株屎肠球菌,这为后续禽类益生菌制剂的开发 研究提供了菌株来源。 

1 材料与方法 

1.1 材料 

1.1.1 分离材料 

  健康雏鸡北京某养殖场提供。 

1.1.2 菌种 

   屎肠球菌 HEW - A511 由北京好实沃生物技术 有限公司提供,作为生理生化鉴定中的模式菌株, 在 MRS 培养基上培养; 大肠杆菌、金黄色葡萄球 菌和沙门菌由北京好实沃生物技术有限公司提供。 

1.1.3 供试主要培养基和试剂 

   基因组 DNA 提取试剂均为进口试剂,如十二 烷基硫酸钠 ( SDS) 、三羟甲基氨基甲烷 ( Tris 碱) 和十六烷基三甲基溴化铵 ( CTAB) 等; 屎肠球菌 16S rDNA PCR 扩展引物 27F: 5' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3'和 1492R: 5' - TACGGCTACCTTGTTACGACTT - 3',dNTP,TaqDNA 聚合酶等均购 自生物工程 ( 上海) 有限公司; KF 链球菌琼脂培 养基,MRS 培养基,LB 培养基等; 其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.4 试验仪器 

   电子天平 ( JA2003,上海舜宇恒平科学仪器有 限公司) ,数字酸度计 ( PB - 10,德国赛多利斯科 学仪器 ( 北京) 有限公司) ,自动凝胶图像分析系 统 ( GelDoc - It 200,Ultra - Violet ProductsLtd 公 司) ,PCR 仪 ( MG48 +型,杭州朗基科学仪器有限 公司) ,恒温振荡培养箱 ( HZC - 250,江苏省太仓 市实验设备厂) ,高速冷冻离心机 ( T -42K 型,德 国 KONTRON 公司) 。 

1.2 方法 

1.2.1 屎肠球菌的初筛 

   在无菌条件下,采集健康雏鸡的盲肠内容物, 用灭菌氯化钠注射液稀释到10 -4,取100 μL 涂布于 KF 链球菌琼脂培养基平板上,37 ℃厌氧培养 24 ~ 48 h 后,挑取红色或粉红色的菌落进行纯化,将纯 化后的菌株,在 MRS 斜面上进行纯培养,于 4 ℃ 冰箱保存备用。 

1.2.2 生理生化鉴定 

   主要试验项目: 革兰染色、氧化酶、10 ℃ 生 长、45 ℃生长、耐 6. 5% NaCl、pH 10. 0 生长、精 氨酸双水解酶和糖醇类利用等生理生化反应。以上 生理生化反应试验方法参照东秀珠的 《常见细菌系 统鉴定手册》和第八版 《伯杰系统鉴定手册》中的 试验方法进行。 1.2.3 16S rDNA 分子鉴定 

   通过目的菌株的形态和生理生化特性,初步筛 选出屎肠球菌疑似菌株,然后对其 16S rDNA 进行 分析。首先,采用 CTAB 法提取细菌基因组 DNA, 获得疑似菌株的基因组 DNA 后,通过引物 27F 及 1492R 对其 16S rDNA 基因片段进行 PCR 扩增。 PCR 扩增体系 ( 25 μL) 及反应条件见表1。用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的质量,并回收纯 化 PCR 产物,送生物工程 ( 上海) 有限公司测定 疑似屎肠球菌的 16S rDNA 基因序列。将所得基因 序列与 GenBank 数据库中的已知菌株的16S rDNA 序列进行BLAST比对,比对结果用MEGA5. 0软件对目的菌株进行系统发育分析。 

表1 屎肠球菌的 PCR 扩增体系 (25 μL) 及反应条件 


2 结果与分析 

2.1 细菌的初步分离观察 

  通过 KF 链球菌琼脂对健康雏鸡盲肠内容物进 行细菌分离,获得1 株疑似屎肠球菌的菌株,将其 命名为 HEW - A527,在 MRS 培养基上菌落较小, 乳白色,呈圆形,直径约 1 mm,形状比较规则, 表面光滑且湿润易挑起,革兰染色呈阳性,无芽 孢,无荚膜,无鞭毛,菌体呈球形,成对、成链或 聚团排列 ( 见图1) 。

图1 HEW - A527 菌落革兰染色形态及显微形态 

2.2 生理生化鉴定结果 

   从表 2 可见: HEW - A527 在 10 和 45 ℃下生 长且氧化酶试验为阴性,精氨酸双水解酶为阳性。 通过与屎肠球菌模式菌株比较可初步鉴定 HEW - A527 为屎肠球菌。 

表2 分离菌的主要生理生化特征

2.3 16S rDNA 分子鉴定结果 

   通过 CTAB 法提取菌株 HEW - A527 的基因组 DNA,并进行 16S rDNA 进行 PCR 扩增,获得菌株 HEW - A527 的 16S rDNA PCR 产物,片段大小在1 500 bp 左右 ( 见图2) 。 通过对获得的 16S rDNA PCR 产物进行测序, 获得菌株 HEW - A527 的 16S rDNA 序列,大小为 1 425 bp。

注: M 为 DL2 000 ladder,1 和2 为16S rDNA 基因 ( 1 为屎肠球菌模 式菌株; 2 为 HEW - A527)

图2 16S rDNA 基因 PCR 扩增电泳结果 


   用 MEGA4. 0 软件进行构建系统进化树 ( 见图 3) ,可知菌株 HEW - A527 与屎肠球菌聚于同一分 支,且同源性达99%。通过菌株 HEW - A527 的形 态特征、生理生化特性及 16S rDNA 序列分析,确 定菌株 HEW - A527 为屎肠球菌。

图3 屎肠球菌和其他参考株16S rDNA 序列的系统进化树 

3 讨论与结论 

   在微生态制剂的研究中,筛选出优良益生性能 的工业菌株是非常关键的。目前,大多数的益生菌 为体外筛选获得,体外和体内环境差异较大,外源 微生物进入动物体内,必须经过定植、竞争和排斥 才能在动物体内存活,所以微生态制剂的作用效果 主要取决于菌种的来源。肠球菌分布较广泛,主要 存在于人、动物肠道、食品及少数临床样品中等。 现在有许多研究者认为,优秀的益生菌最好来源于 动物肠道,而且不同动物肠道的菌群不同,所以菌种的来源应该和使用的对象相一致,从鸡肠道中分 离获得的菌株制成的微生态制剂更有利于其在禽类 肠道内定植且发挥作用。研究通过 KF 链球菌琼脂 培养基从健康雏鸡肠道中分离获得了一株疑似肠 球菌的菌株,通过形态学鉴定、生理生化鉴定和 16S rDNA 分子鉴定为屎肠球菌,即 HEW - A527。 研究获得的屎肠球菌可通过后处理加工后,作为饲 料添加剂应用于动物,无毒、无害、无污染且环保 安全。研究只对获得的菌株进行了鉴定,将对其益 生性能做后续研究,深入探讨这株屎肠球菌的益生 性,并将其添加到动物饲料中,观察其应用效果。

参考文献

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2018年6月8日 14:42
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