一株抗逆性芽孢杆菌的分离鉴定
一株抗逆性芽孢杆菌的分离鉴定
汤立
北京好实沃生物技术有限公司,北京101399
摘 要:本试验通过对健康鸡肠道内容物高温处理后,筛选获得5株芽孢杆菌,并进行耐酸试验、耐胆盐试验及抑菌试验,最终获得一株抗逆性最强的菌株HEW-Y4,并对其进行形态观察、生理生化试验及16SrDNA序列同源性分析,最终确定其为地衣芽孢杆菌。
关键词:抗逆性,芽孢杆菌,分离鉴定
近年来,人们对绿色安全畜禽产品的呼唤,以及对自身健康、绿色环境的重视,政府部门也加大了饲料生产及绿色养殖的监督力度,已全面实施绿色畜禽养殖的工程[1]。动物微生态制剂在畜牧业中应用非常广泛,研究报道较多,并表现出良好的效果,应用遍及单胃动物、反刍动物及水产动物等。动物微生态制剂的种类也越来越多,包括乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母和曲霉等,乳酸杆菌及其他菌均不奶搜饲料加工的高温及长期存放,而芽孢杆菌则可在不利条件下产生芽孢,可耐受饲料加工的高温环境、耐储藏及耐胃酸等仍保持较高的活性,并能在肠道中萌发,为宿主提供营养物质、促进动物生长以及提高饲料转化率[2,3]。
本研究从健康鸡肠道中分离获得5株芽孢杆菌,并对其进行抗逆性筛选,最终获得抗逆性较强的芽孢杆菌,然后对其生理生化特性及16SrDNA鉴定,为芽孢杆菌的研究奠定基础,并丰富了动物微生态制剂的菌种。
1 材料与方法
-
- 试验动物
试验选用健康肉鸡购自某养殖场。
1.2 培养基
牛肉膏蛋白胨(NA)培养基、淀粉水解培养基、纤维素水解培养基、耐盐培养基、糖醇发酵培养基、明胶液化培养基、丙酸盐培养基、VP试验培养基等生理生化培养基。
1.3 芽孢杆菌的分离
1.3.1 样品获得
无菌采集健康肉鸡的肠道内容物置于无菌离心管中,并加入10倍灭菌生理盐水,混匀,稀释至10-3倍。
1.3.2 芽孢杆菌分离纯化
从健康鸡肠道获得其肠道,置于灭菌塑封袋中,在无菌条件下取肠道内容物1g于9mL灭菌生理盐水中,混匀并于85℃水浴锅水浴15min,再进行十倍梯度稀释,并取合适的稀释液100μL分别于NA培养基上涂布均匀,至少三个重复,37℃倒置培养24h-48h。挑取形态不同的菌落在NA培养基上划线纯化培养24h-48h,至少纯化三次,并进行斜面活化,4℃保藏备用。
1.4 抗逆性芽孢杆菌筛选鉴定
1.4.1 耐酸试验
将获得的菌株分别接种于pH分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和7.0(未加盐酸)的NA培养基中,充分混匀后,静置培养3h,进行计数,至少三个重复,并计算芽孢杆菌的存活率。
1.4.2 耐胆盐试验
将获得的菌株分别接种于胆盐浓度分别为0%(空白对照)、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%和0.4%的NA培养基中,充分混匀后,静置培养3h,进行计数,至少三个重复,并计算芽孢杆菌的存活率。
1.4.3 抑菌试验
分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌进行液体培养,并稀释使其浓度为10-7cfu/mL,涂布在NA平板上备用,将获得的菌株同样进行液体培养后,离心去菌体,获得上清液备用。将含有病原菌的NA平板上分别放置牛津杯,然后将每个牛津杯中分别加入获得菌株的液体发酵液200μL。于37℃恒温培养箱中培养24-48h,观察试验结果,至少做三个重复。
1.5 芽孢杆菌鉴定
1.5.1 形态鉴定及染色观察
观察NA平板上菌落形态,并将纯化后获得的菌株进行革兰氏染色,并观察菌株的显微形态。
1.5.2 生理生化鉴定
参照《常用细菌系统鉴定手册》[4]将分离获得的菌株进行各种糖发酵、接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、丙酸盐、明胶液化等试验,初步鉴定其种类。
1.5.3 16SrDNA鉴定
通过DNA提取试剂盒提取获得菌株的基因组DNA,并进行PCR扩增,PCR产物进行电泳检测,回收所得PCR产物,进行测序,序列经BLAST比对初步鉴定种属,进行系统发育分析。
2 结果与分析
2.1 抗逆性试验结果
从鸡肠道内容物中分离获得5株芽孢杆菌(命名为HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4、HEW-Y5),进行耐酸性、耐胆盐及抑菌试验。5株芽孢杆菌在不同pH溶液中存活率如表1所示,结果显示,菌株HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4及HEW-Y5能耐受pH1.5~4.0的酸性环境,且菌株HEW-Y4的耐酸性能最强,其在pH1.5溶液3h,存活率达到70.47%,HEW-Y1和HEW-Y5存活率在60%以上,分别为63.25%、61.27%,HEW-Y2 和HEW-Y3存活率分别为42.98%、37.52%,表明这五株菌均能耐受体外强酸环境。
表1 获得的菌株在不同pH溶液中的存活率
pH |
1.5 |
2.0 |
3.0 |
3.5 |
4.0 |
7.0 |
HEW-Y1 |
63.25% |
65.42% |
70.79% |
80.26% |
85.18% |
99.24% |
HEW-Y2 |
42.98% |
54.96% |
63.77% |
69.38% |
83.44% |
99.35% |
HEW-Y3 |
37.52% |
47.62% |
58.82% |
71.77% |
80.37% |
99.18% |
HEW-Y4 |
70.47% |
78.48% |
80.16% |
87.45% |
90.82% |
99.97% |
HEW-Y5 |
61.27% |
65.89% |
78.35% |
82.17% |
87.63% |
99.42% |
5株芽孢杆菌在不同胆盐浓度的溶液种存活率如表2所示,可知这几株菌随着胆盐浓度的增加,它们的存活率均有不同程度降低,当胆盐浓度达到0.3%时,作用2h,HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4、HEW-Y5存活率分别为75.72%、78.25%、76.24%、86.73%、82.52%,表明这几株菌均对胆盐较强耐受力,均能够体外模拟的高胆盐环境,其中菌株HEW-Y4的耐胆盐性能最强。
表2 获得的菌株在不同胆盐浓度溶液中的存活率
胆盐浓度 |
HEW-Y1 |
HEW-Y2 |
HEW-Y3 |
HEW-Y4 |
HEW-Y5 |
0% |
100% |
100% |
100% |
100% |
100% |
0.05% |
87.34% |
95.45% |
89.45% |
98.36% |
94.24% |
0.1% |
85.78% |
92.11% |
88.54% |
96.79% |
92.28% |
0.15% |
81.89% |
87.44% |
87.26% |
92.88% |
88.76% |
0.2% |
778.74% |
85.47% |
85.96% |
89.75% |
85.34% |
0.25% |
77.63% |
83.55% |
79.52% |
88.64% |
84.53% |
0.3% |
75.72% |
78.25% |
76.24% |
86.73% |
82.52% |
0.35% |
72.67% |
76.14% |
75.39% |
83.68% |
79.37% |
0.4% |
70.94% |
74.22% |
71.72% |
81.95% |
77.74% |
菌株HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4及HEW-Y5对病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌试验表明,这五株菌菌对大肠杆菌有较强的抑制作用,菌株HEW-Y1、HEW-Y3及HEW-Y4对金黄色葡萄球菌有抑菌效果,菌株HEW-Y2、HEW-Y4、HEW-Y5对沙门氏菌有抑菌效果,表明菌株 HEW-Y4对病原菌的抑制效果最佳。
综合菌株HEW-Y1、HEW-Y2、HEW-Y3、HEW-Y4及HEW-Y5的耐酸试验、耐胆盐试验及抑菌试验考虑,发现菌株HEW-Y4能够耐受体外模拟酸环境和高胆盐环境,且抑菌性能最佳,因此将菌株HEW-Y4确认为一株抗逆性较强的菌株,为下一步研究做准备。
2.2 形态特征及染色结果
菌株HEW-Y4菌落形态及显微形态如图1所示。在NA平板上菌落菌落呈圆形不透明,表面干燥且粗糙,边缘薄,不易挑起,革兰氏染色为阳性,杆状,单个或成对排列,产芽孢。
图1 菌株HEW-Y4菌落形态及显微形态图
2.2生理生化鉴定
菌株HEW-Y4的部分生理生化试验结果如表3所示,HEW-Y4能够利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖等,液化明胶,水解淀粉和酪氨酸,V-P试验和过氧化氢酶试验为阳性等。参照《常见细菌系统鉴定手册》可初步鉴定HEW-Y4为地衣芽孢杆菌
表3 HEW-Y4部分生理生化试验结果
菌株 |
HEW-Y4 |
菌株 |
HEW-Y4 |
葡萄糖 |
+ |
棉籽糖 |
- |
半乳糖 |
+ |
甘露醇 |
+ |
果糖 |
+ |
酪氨酸水解 |
+ |
乳糖 |
+ |
淀粉水解 |
+ |
蔗糖 |
+ |
明胶液化 |
+ |
麦芽糖 |
+ |
V-P试验 |
+ |
木糖 |
+ |
厌氧生长 |
+ |
阿拉伯糖 |
+ |
过氧化氢酶 |
+ |
山梨醇 |
+ |
柠檬酸盐 |
+ |
注:“+”表示反应阳性;“-”表示反应阴性
2.3 分子鉴定结果
菌株HEW-Y4的16SrDNA PCR扩增产物大小为1462bp,琼脂糖凝胶电泳如图2所示。菌株HEW-Y4的16SrDNA序列进行BLAST比对,发现HEW-Y4与地衣芽孢杆菌序列同源性为99.8%,结合生态学特征及生理生化试验结果考虑,鉴定HEW-Y4为地衣芽孢杆菌。
图2 菌株HEW-Y4的琼脂凝胶电泳图
3 讨论
微生态制剂可有效调整肠道微生态平衡、促进动物生长、降低料肉比及死亡率、提高宿主免疫力等功效。但在实际应用中,微生态制剂的效果不稳定,除了与宿主动物的年龄、生理状态有关外,菌种本身的特性也是关键[5]。微生态制剂添加在饲料中,随着饲料一起进入动物体内,先到达胃部,胃液是一个含有胃蛋白酶的酸性环境中,再到达机体最重要的吸收器官小肠,肠液中含有胰蛋白酶、胰脂肪酶等各种酶及胆盐等,益生菌必须要想发挥作用,必须能够在胃肠道中存活,并达到一定数量。所以,益生菌必须能够耐受胃酸液、肠液及胆盐等,才能有效地发挥作用。芽孢杆菌能够形成抗逆性强的芽孢休眠提,可以在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的芽孢休眠体,可耐受各种不利条件[6,7]。本研究通过热处理健康鸡肠道内容物,获得五株杆菌,并通过耐酸试验、耐胆盐试验及抑菌试验,复筛获得一株抗逆性强的芽孢杆菌HEW-Y4,其在pH为1.5的酸溶液中处理3h,存活率为70.47%,0.4%胆盐溶液存活率为81.95%。
传统的鉴定方法一般是通过形态学和生理生化鉴定,来粗略鉴定,其耗时较长,容易受干扰且产生误差[8]。近年来,基于生物技术的快速发展,微生态的鉴定方法也发生了日新月异的变化,16SrRNA携带充分的生物信息,能够用于系统进化分析,通过进行比对16SrRNA序列来确定微生物的分类地位,其简单方便且准确性高[7]。本研究通过对菌株HEW-Y4菌落形态观察、镜检、生理生化试验、16SrDNA序列分析以及同源性分析,最终确定菌株HEW-Y4为地衣芽孢杆菌。
参考文献
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- 海洋,赵玉军,陈晓月,等.鸡肠道芽胞杆菌的分离鉴定及产蛋白菌株的筛选试验[J].浙江畜牧兽医,2008,33(6):5-6.
- 东秀珠,蔡妙英,等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.
- 许云贺,曹新民,张莉力,等.枯草芽孢杆菌HY4体外益生性能的研究[J].饲料研究,2014,(5):4-6.
- 唐建中,戴求仲,周旺平.高温处理及试验制粒对两种有益芽孢杆菌的影响[J].饲料博览,2009,(4):25-27.
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