屎肠球菌抗噬菌体菌株的筛选

卓立应汤立

北京好实沃生物技术有限公司，北京101399

摘要：本试验通过次级感染，诱使屎肠球菌HEW-A503自发突变的方法筛选32株耐噬菌体的抗性菌株。通过对32株噬菌体耐性菌株的传代稳定性和噬菌体抗性的测定，最终获得2株具有稳定的噬菌体抗性及良好的发酵性能的噬菌体抗性菌株，分别是HEW-A503_k1₈和HEW-A503_k₂₂。这2株抗性菌株连续传代20次，仍能在加注噬菌体的培养基中正常生长；噬菌体抗性EOP值均<1.0×10^-8；生长特性、产酸性能亦优于原始菌株。为发酵生产受噬菌体污染时提供了后备替换菌种资源。

关键词：粪肠球菌；抗噬菌体菌株；筛选

1907年和1909年噬菌体分别由Twort和D·Herelle各自独立发现。它是感染细菌、真菌、藻类等微生物的病毒的总称，因能引起宿主菌的裂解，故名噬菌体。噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小，只有单一核酸，无完整细胞结构。利用微生物细胞中的核糖体、蛋白质等合成自身生长和增殖所需各种因子、氨基酸和能量，一旦离开了宿主细胞，噬菌体即不能生长，也不能复制。噬菌体的寄生具有高度专一性，这一特性是由宿主细胞的表面构造和噬菌体的构造所决定的^[1]。噬菌体又具有相对的广谱性，对各菌种同一类型菌体均有侵蚀作用^[2]，某个菌种的专一噬菌体还可能会诱导其他菌种噬菌体的产生而形成广谱性的噬菌体。

现代发酵工业趋向大容积发酵罐及连续发酵工艺，对噬菌体的生长、繁殖和传播提供了有利条件，微生物发酵生产过程中，一旦感染噬菌体，发酵过程很快停止，菌体也会迅速消失，造成严重的经济损失。而且，一旦发生噬菌体感染，若不及时采取有效措施，往往会造成发酵生产的连续失败，给企业带来巨大的损失。目前对于噬菌体污染的防治主要方法有三种：一是以环境净化为中心的综合防治措施；二是抗噬菌体菌株的选育及应用；三是合理添加适量化学试剂^[3]干扰噬菌体的生长增殖防治噬菌体感染。

烈性噬菌体的感染过程一般分为吸附、注入、复制、装配和释放5个阶段^[4]。微生物暴露在高浓度噬菌体环境中，有些会自发突变为噬菌体抗性菌株^[5]。饲料添加剂中的微生物制剂主要是利用活菌制剂在动物肠道中发挥作用，特别是乳酸菌需要活细胞到达肠道发挥作用，因此，饲料添加剂中的益生菌均用活菌数来评判产品质量，如果生产过程中发生噬菌体感染，将会给我们的生产造成非常严重的后果，甚至影响企业的发展。本试验采用自发突变的方法筛选具有优良发酵性能的耐噬菌体的屎肠球菌抗性菌株，为饲料添加剂微生物发酵工业噬菌体的污染防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

屎肠球菌HEW-A503由本实验室分离筛选获得，其具有良好的稳定性和应用效果，在常规的MRS培养基上正常培养；噬菌体：BP-33由本实验室筛选获得。

1.2 培养基

MRS培养基：葡萄糖20g，牛肉膏10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二胺2g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2，115℃灭菌30min。固体培养基在液体培养基的基础上加入1.8%的琼脂。

1.3 实验方法

1.3.1 屎肠球菌菌种活化及种子液制备

取斜面保藏的屎肠球菌HEW-A503在MRS平板上划线，37℃培养36~48h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养16h，即屎肠球菌HEW-A503的种子液。

1.3.2 噬菌体感染及抗性菌株的筛选

将种子液以1%的接种量接种至新鲜MRS培养基中，37℃，180r/min振荡培养至OD₆₀₀于0.5~0.8之间。以感染复数1.0接入噬菌体BP-33，继续培养24h。涂布MRS平板（剩余裂解液10000r/min离心5min，取上清液以无菌操作用0.22μm微孔滤膜过滤去除菌体，并与40%甘油等比例混合，4℃保藏备用），37℃培养48h，挑取单菌落接种至MRS液体培养基中培养。培养液连续3次划线分离单菌落，获得纯种菌株，斜面保藏。

1.3.3 噬菌体抗性菌株的传代稳定性及抗性检测

将初筛获得的抗性菌株接种至MRS液体培养基中，接入噬菌体BP-33，如此连续传代20次，并以同等培养条件下不接入噬菌体为对照，观察粪肠球菌抗性菌的生长情况。

抗噬菌体菌株的抗性用EOP表示，即用等量的噬菌体分别以抗性菌株及原始菌株为指示菌时所形成噬菌斑数（pfu/mL）之比^[4]。

1.3.4 噬菌体抗性菌株的发酵性能测定

为确保筛选获得的各抗性菌株作为生产菌株的实用性，将各抗噬菌体菌株与原始菌株EF-31接种至MRS液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养16h，在第5个小时接入噬菌体HEW-A503，并以原始菌株未接入噬菌体作为对照，测定其生长曲线及产酸曲线。每1h取样10mL，平板活菌计数法检测其活性绘制生长曲线，并测pH值绘制产酸曲线。

2 结果与分析

2.1 抗性菌株的筛选

本次试验共筛选获得32株自发突变的抗噬菌体的屎肠球菌菌株，表面光滑、有光泽的圆形白色小菌落，镜检为圆形或椭圆形球菌。分别编号HEW-A503_k1~k32。

2.2 噬菌体抗性菌株的传代稳定性

从表1可知：筛选所得32株抗性菌株按感染复数1.0接入噬菌体与不接入噬菌体连续20次传代对比，仅有5株抗性菌株20次传代均能正常生长，拥有良好的抗性传代稳定性。这5株抗性菌株分别为：HEW-A503_k₂、HEW-A503_k₁₀、HEW-A503_k₁₈、HEW-A503_k₂₂、HEW-A503_k₂₅。

表1 25株抗性菌株传代稳定性结果

菌株编号	传代次数
菌株编号	2	4	6	8	10	12	14	16	18	20
HEW-A503_k1	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₂	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
HEW-A503_k₃	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₄	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₅	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-
HEW-A503_k₆	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₇	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-
HEW-A503_k₈	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₉	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₁₀	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
HEW-A503_k₁₁	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-
HEW-A503_k1₂	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k1₃	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k1₄	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-
HEW-A503_k1₅	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k1₆	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k1₇	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-
HEW-A503_k1₈	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
HEW-A503_k1₉	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₂₀	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₂₁	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-
HEW-A503_k₂₂	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
HEW-A503_k₂₃	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₂₄	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₂₅	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
HEW-A503_k₂₆	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-
HEW-A503_k₂₇	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-
HEW-A503_k₂₈	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₂₉	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₃₀	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₃₁	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
HEW-A503_k₃₂	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-

注：“+”表示菌株正常生长，“-”表示菌株未生长。

2.3 噬菌体抗性菌株的抗性结果

采用双层平板法测定5株具有良好传代稳定性的噬菌体抗性菌株对噬菌体BP-33的抗性发现，以抗性菌株为指示菌与噬菌体共同培养，均无噬菌斑，其EOP值均<1.0×10^-8。

2.4 噬菌体抗性菌株的生长特性

如图1所示，为本试验筛选出的5株具有传代稳定性的抗噬菌体菌株及原始菌株HEW-A503的生长曲线。可以看出，在接入噬菌体后，原始菌株活性迅速下降，仅有极少量存活，而对抗噬菌体菌株的生长无太大影响，说明抗噬菌体菌株可以在噬菌体存在时生长，与原始菌株未接噬菌体发酵生长曲线对比，有3株活性明显高于原始菌株，分别为HEW-A503_k₂、HEW-A503_k₁₈、HEW-A503_k₂₂，其中菌株HEW-A503_k₁₀与原始菌株相差不大，其中菌株HEW-A503_k₂₅活性明显偏低。

图1 屎肠球菌原始菌株及5株抗性菌株生长曲线

2.4 噬菌体抗性菌株的产酸性能

因发酵培养8h到稳定期后，pH变化不大，产酸曲线仅绘制到8h。如图2所示，接入噬菌体后，原始菌株pH值基本无变化，而对抗噬菌体菌株的生长无太大影响，说明抗噬菌体菌株可以在噬菌体存在时生长，与原始菌株未接噬菌体发酵产酸曲线对比，有2株产酸速度明显高于原始菌株，分别为HEW-A503_k₁₈、HEW-A503_k₂₂；菌株HEW-A503_k₂与原始菌株相差不大。

图2 屎肠球菌原始菌株及3株抗性菌株产酸曲线

3 讨论

在屎肠球菌HEW-A503的正常发酵液中人为感染噬菌体BP-33使其自发突变的方法，由于不涉及基因相关操作，筛选获得耐噬菌体的抗性菌株的实验简单而方便。本次试验共获得32株具有噬菌体抗性的菌株，其中仅有5株具有传代稳定性。通过对5株有传代稳定性抗性菌株的生长特性及产酸特性的研究，发现这些噬菌体抗性菌株的发酵特性与原始菌株HEW-A503基本一致，其中菌株HEW-A503_k₁₈、HEW-A503_k₂₂表现出稳定的噬菌体抗性及良好的发酵性能。噬菌体污染给发酵工业带来了严重的后果，通过本研究为发酵生产防治噬菌体污染带来了菌种储备，也为噬菌体的污染防治提供了依据。

参考文献

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