丁酸梭菌C-101益生性及抗逆性研究

好实沃生物，北京101399

摘要：本研究以一株丁酸梭菌C-101作为实验菌株，从抑菌能力，耐热性，耐人工胃液，人工肠液，人工胆盐能力几个方面，分析了其作为微生态制剂菌种的潜力，实验结果可知，该菌株耐热性良好，80摄氏度处理5min，存活率仍达到99.0%，人工胃液处理2h，存活率87.8%，人工肠液处理2.5h，存活率98.9%，0.4%胆盐处理，生长情况良好，能够抑制常见的致病菌：大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，单增李斯特菌，益生性能优良，可以作为微生态菌剂开发菌种。

关键词：微生态制剂，益生性，抗逆性

Study on the  probiotic and resistance of Clostridium butyrate C-101

Zhang nan, Li Xue-Ping

 Heswof Biotechnology  Beijing 101399, China

In this research, a Clostridium butyrate C-101 was used as an experimental strain. Several aspects, including antibacterial ability, heat resistance, resistance to artificial gastric fluid, artificial intestinal fluid, artificial bile salt, were studied  to analyzed the potential of it as a microecological agent.  The results showed that: the strain had a good a outstanding capacity of heat resistance, treated of 5min at 80 degrees, its survival rate  reached 99.0 %,  disposed in artificial gastric juice for 2H, survival rate 87.8 %, artificial intestinal fluid treatment 2.5 H, survival rate 98.9 %, treatment in 0.4 % bile salt , it could inhibit common pathogenic bacteria: E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Listeria Monocytogenes, and be used as microecological fungicide development species.

Keyword: microecological preparation, probiotic, resistance

       丁酸梭菌（Clostridium butyricum）属于厌氧革兰氏阳性菌，电子显微镜下观察其菌体形态呈直或略有弯曲的杆状，单个或成对，部分呈丝状，短链，白色略带灰感，细菌直 径为（0.6～1.4）×（2.7～7.3）μm，菌体中间略饱满，两端呈 钝圆形，周身有鞭毛，具运动性^[1]，广泛存在于奶酪、天然酸奶、酒窖泥、土壤及人与动物粪便中^[2]。丁酸梭菌代谢过程中主要产物为丁酸，在反刍动物肠道中，丁酸能够被结肠上皮细胞代谢利用并产生能量。做为产芽孢菌，丁酸梭菌具有耐热、耐酸、耐多种抗生素等能力^[3]，可调节动物肠道内的微生态平衡，具有调整肠道功能的作用。丁酸梭菌还具有抗癌、提高机体免疫力、抗氧化等作用，目前已被制成微生态制剂广泛地用于保健食品^[4]。

2009丁酸梭菌被农业部批准，允许作为活菌制剂在饲料中添加。微生态制剂能否作为活菌制剂被应用，取决于菌种的益生性能，以及其在后续加工过程中的抗逆性，能够保证微生态制剂有效活菌数及产品的稳定性。丁酸梭菌作为一种梭状芽孢杆菌，具有一定耐高温、耐动物胃肠道环境的能力，但是这些特性在不同菌株之间存在较大的差异。所以，研究丁酸梭菌的益生性能及抗逆性显得尤为重要，本研究中，以实验室筛选得到的一株丁酸梭菌C-101为实验菌株，研究了其高温耐受能力，抑菌能力，耐胃酸，耐胆盐能力，为该菌株的应用提供了理论基础。

1. 实验材料与方法

1.1菌株

       丁酸梭菌C-101：由北京好实沃生物技术有限公司保藏提供。

指示菌：大肠埃希氏菌（Escherichiacol），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），单核细胞增生李斯特菌（Listeria Monocytogenes，肠炎沙门氏菌（S. enteritidis）。

1.2实验材料

       强化梭菌培养基（reinforced clostridial medium，RCM）、LB琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）培养基。

种子培养基：RCM液体培养基。

丁酸梭菌发酵培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉粉 10.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉1.0 g，L-半胱氨酸盐粉 3.0 g，磷酸氢二钾 0.05 g，硫酸镁0.08 g，硫酸锰0.002 g，纯化水1000 mL，pH 7.0^[5]。

以上培养基制备完成后均需高压灭菌备用，灭菌温度121℃，灭菌时20min。

人工胃液，人工肠液的配制参照《中国药典》。

1.3 实验方法

1.3.1抑菌能力实验

       菌种准备：将甘油管保藏的丁酸梭菌C-101 0.1 mL接种到10 mL液体RCM培养基中，厌氧培养18 h，备用。将活化好的菌株接种于种子培养基，厌氧培养24 h，再按5%接种量，接种于发酵培养基，37℃厌氧培养48h后备用。

将大肠杆菌、沙门氏菌划线接种于LB固体培养基上37 ℃培养24 h， 依次用无菌生理盐水洗脱菌体，制备菌悬液，并将菌悬液的菌浓度稀释为10⁶CFU/mL，备用。

将金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌接种于TSA固体培养基上，于37 ℃条件下培养24 h，依次用生理盐水洗脱，制备菌浓度为10⁶CFU/mL左右的菌悬液后，备用。

指示菌平板的制备：采用双层平板法制备指示菌平板。取15 mL培养基加入到培养皿，凝固后作为下层；取5 mL含2%不同指示菌菌悬液的培养基加入凝固后的下层培养基上作为上层，待用。

采用牛津杯法测定抑菌活性。在牛津杯中加入200 μL丁酸梭菌发酵上清液，于37 ℃条件下 培养16～18 h，观察并测量抑菌圈直径。每组测定两个重复。

1.3.2 菌悬液的制备

       将活化好的菌株C-101种至种子培养基中，37 ℃厌氧培养24 h后，按5%接种量接种至发酵培养基，37 ℃厌氧培养48 h，发酵培养结束后，3 000 r/min离心10 min，收集菌体，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤两次后重悬，使菌体浓度为4.5×10⁸CFU/mL，备用。

1.3.3耐热性试验

       取上述菌液样品1 mL到含9 mL甘油溶液（80%甘油）的试管中，充分混匀，分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、 90 ℃、100 ℃的水浴中处理5 min，置于0 ℃冰水混合物中冷却，3000 r/min离心10 min，收集菌体，PBS洗涤两次后重悬，采用梯度稀释平板法测定其活菌数，每个样品重复3次，计算存活率，其计算公式如下：

存活率=处理后活菌数/处理前活菌数×100%

1.3.4人工胃液耐受性试验

       取上述样品菌液1 mL到9 mL人工胃液中，人工胃液最终pH值调为1.5左右，振荡混匀，37 ℃水浴，每隔0.5 h取样，将经过人工胃液处理后的菌悬液，3000 r/min离心10 min，PBS洗涤两次后重悬，梯度稀释法进行计数，每个样品3个平行，计算存活率。

1.3.5人工肠液耐受性试验

       取上述样品菌液1 mL到9 mL人工肠液中振荡混匀， 37 ℃水浴2.5 h，毎隔0.5 h取样，3 000 r/min离心10 min， PBS缓冲液洗涤两次后重悬，采用梯度稀释法进行活菌计数，每个样品3个平行，计算存活率。

1.3.6胆盐耐受性试验

       在RCM液体培养基中加入不同浓度的猪胆盐，使其浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，混匀，121 ℃、 15 min灭菌后备用。按10⁷ CFU/mL接种量分别接种丁酸梭菌C-101，厌氧培养24 h，检测活菌数，每个样品重复3次。

2. 实验结果与讨论

2.1 抑菌实验

      丁酸梭菌代谢产生的有机酸能够降低肠道pH，同时产生细菌素，抑制肠道中致病菌的生长，丁酸梭菌对常见致病菌抑制能力结果如表1所示，结果显示，丁酸梭菌C-101对常见致病菌具有显著抑制能力，由于其产生的抑菌物质非单一有机物，所以，其抑菌物质仍待进一步的研究。

表1 C-101对常见致病菌抑菌效果

2.2 耐热性实验

由表2可知，丁酸梭菌C-101具有良好的耐热性，80摄氏度处理5min后，存活率仍可达99.5%，温度继续升高，存活率下降，对于饲料加工过程，需缩短热处理时间。

表2 C-101耐热性能

2.3人工胃液耐受性

表3 C-101人工胃酸耐受性

动物胃液为酸性，pH一般在2.5-3.0^[6]，微生态制剂能否达到肠道发挥效应，需经过胃液，并保持一定的活性，由表3可知，丁酸梭菌经人工胃液处理后2.5h后活菌数仍能够保持较高水平，活性降低13.3%，性状优良，可以作为微生态制剂生产用菌种。

2.4人工肠液耐受性

表4 C-101人工肠液耐受性

由表4可知，丁酸梭菌C-101对人工肠液具有很好的耐受性，人工肠液处理2.5 h，活菌数均为 4.45×108 CFU/mL，存活率98.9%，说明该菌株在肠道内保持较高的存活率。

2.5 胆盐耐受性

图1 C-101胆盐耐受性

动物肠道内胆盐的质量分数约为0.03%-0.30%，菌株能否在肠道中定植，取决于菌株对胆盐的耐受能力[7]。由图1可知，菌株C-101对胆盐具有很好的耐受性，在人工胆盐浓度0.4%条件下能够正常生长，当胆盐浓度达到0.5%时受到抑制，可以保证其顺利地通过小肠，并最终成功定殖于动物肠道后端。

3. 结论

本研究以实验室分离保藏的一株丁酸梭菌C-101为实验菌株，对其抑菌能力，耐热性，人工胃液，人工肠液，人工胆盐耐受性，实验结果显示，该菌株对常见致病菌由显著的抑制效果，耐热性良好，能够耐受饲料制粒或加工过程的热处理过程，对胃酸，肠液，胆盐耐受性能优良，具有良好的应用潜力。 

参考文献

[1] 赵建新，张灏，田丰伟. 丁酸菌的分离、鉴定及筛选[J]. 食品与生物 技术学报，2002（6）：597-601，612.

[2] 桂国弘，徐娥，杨华，等．丁酸梭菌调节肠道健康的作用机制 ［J］． 饲料研究，2016( 22) : 42－46．

[3] 田召芳，李春蕾，党安坤． 丁酸梭菌作用机理与研究进展［J］． 中国畜禽种业，2017( 8) : 36－38．

[4] 熊祖明，袁杰利． 酪酸梭菌的研究与应用进展［J］． 中国微生态学杂志，2011，23( 12) : 1143－1145．

[5] 谢丽静，王丽，王伟华等，丁酸梭菌优良菌株LXYB-2抑菌活性及抗逆性研究［J］，中国酿造，2018,37（6）:91-96

[6] 陈桂芳，刘艳，单春乔，等. 费氏丙酸杆菌生物学特性及与5株益生菌拮抗性试验研究[J]. 中国酿造，2018，37（1）：69-73.

[7] 张媛媛. 复合芽孢杆菌制剂发酵工艺及其耐受性研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2012.